支气管哮喘患者血清lncRNA PVT1表达与气道炎症、重塑的相关性

禹阳明，王丹，张亚莉

安康市人民医院呼吸科，陕西 安康 725000

支气管哮喘是一种以气道炎症和气道重塑为主要特征的慢性气道异质性疾病，受多种细胞及因子调控。近年来，受环境、遗传等因素影响，我国支气管哮喘发病率呈逐年升高趋势。随着诊治水平和患者对疾病认知程度不断提高，部分城市支气管哮喘控制水平有明显提高，但整体控制水平仍不理想，支气管哮喘发病对居民日常生活造成严重影响[1]。因此寻找支气管哮喘进展中新的生物标志物，对及时评估患者病情和发现新的治疗靶点有重要意义。长链非编码RNA浆细胞瘤变异易位基因1（long non-coding RNA plasmacytoma variant translocation，lncRNA PVT1）位于原癌基因MYC下游，被证实与肿瘤进展有关[2]。ZHANG等[3]研究报道，类风湿性关节炎模型大鼠滑膜组织中lncRNA PVT1高表达，沉默lncRNA PVT1有抑制细胞增殖、减轻炎症反应和诱导细胞凋亡作用。上皮间充质转化过程在支气管哮喘气道重塑中发挥重要作用[4]，SHEN等[5]在胰腺癌中研究发现，lncRNA PVT1可通过调节上皮间充质转化过程，促进癌细胞增殖。由于以往对lncRNA PVT1在支气管哮喘中表达水平及意义研究极少，本研究通过检测支气管哮喘患者血清lncRNA PVT1水平，分析其与患者气道炎症和气道重塑关系，探究其在支气管哮喘进展中意义，以期为临床诊治提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年5月至2020年5月安康市人民医院呼吸科收治的80例支气管哮喘患者作为研究对象，根据支气管哮喘防治指南[6]诊断标准，将入组患者分为急性发作期组43例和慢性持续期组37例。纳入标准：①符合支气管哮喘诊断标准；②病程在1年以上；③临床资料完整。排除标准：①合并患有其他肺部疾病者；②患有免疫性疾病及心、肾、肝脏等器官功能严重不足者；③合并患有恶性肿瘤者；④孕期及哺乳期患者。另选取同期在本院体检显示健康者78例作为对照组。本研究经本院伦理委员会批准同意，所有受试者及家属均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）仪（型号：7500，美国ABI公司）、全自动血细胞分析仪（型号：LH 755，美国Beckman Coulter有限公司）、肺功能检测仪（型号：MS-IOS，德国Jaeger公司）、RNA提取试剂盒（货号：R1200-100，北京索莱宝科技有限公司）、反转录试剂盒（货号：K1622，美国Thermo公司）、人白介素-6（interleukin 6，IL-6）酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：70-EK106/2-96，杭州联科生物技术股份有限公司）、人白介素-17（interleukin 17，IL-17）ELISA试剂盒（货号：E01I0309，上海蓝基生物科技有限公司）、人转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA试剂盒（货号：FY-04048H2，上海富雨生物科技有限公司）、人免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）ELISA试剂盒（货号：GN-H11258，上海盖宁生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集与一般资料收集所有入组支气管哮喘患者和健康者分别于入组时和体检时清晨（7:00～9:00）空腹状态采集外周静脉血5 mL，3 000 r/min条件下离心20 min后取上清液，于-80℃保存备用。收集入组支气管哮喘患者和健康者性别、年龄、身体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟情况及支气管哮喘患者哮喘控制测试（asthma control test，ACT）评分。

1.3.2 血清lncRNA PVT1表达水平检测采用qRT-PCR法检测所有入组者血清lncRNA PVT1表达水平。使用RNA提取试剂盒及反转录试剂盒获得cDNA后，用于qRT-PCR实验。qRT-PCR反应体系（20μL）如下：10µL Mix，0.4µL ROX，2µL cDNA，0.8µL上游引物、0.8µL下游引物，6.0µL无酶水。具体反应步骤如下：95℃、35 s，1个循环；95℃、5 s，63℃、37 s，40个循环。每个样本重复3次，用2-△△CT法计算lncRNA PVT1表达水平。qRT-PCR实验所用引物如表1所示。

1.3.3 血清其他指标测定使用全自动血细胞分析仪进行外周血嗜酸性粒细胞（eosinophil count，EOS）计数，使用ELISA法 进 行血清IL-6、IL-17、TGF-β、IgE水平测定，严格按照仪器和试剂盒操作说明进行操作。

1.3.4 气道重塑及肺功能指标测定经高分辨率胸部CT检查，在CT图片上使用电子标尺测量气道外直径（D）、内直径（L），每张CT连续测量三次，取平均值。计算支气管厚度（T/D）=（D-L）/D；管壁面积占支气道总横截面积百分比（WA%）=（D2-L2）/D2×100%。使用肺功能检测仪进行肺功能指标第一秒用力呼气量（forced expired volume，FEV1）、一秒率预计值（forced expired volume percentage，FEV1%）、最高呼吸气流（peak expiratory flow，PEF）水平测定。

1.4 统计学方法应用SPSS22.0软件对本文中数据进行统计分析，计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两组间比较行独立样本t检验，三组间比较行单因素方差分析，总体有差异时采用SNK-q检验；计数资料比较行检验；采用Pearson法分析支气管哮喘患者血清lncRNA PVT1水平与气道炎症、重塑指标相关性。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组受检者的一般资料比较三组受检者的性别、年龄、BMI、吸烟比例比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。急性发作期组患者的ACT评分明显低于慢性持续期组患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组受检者的一般资料比较[例（%），±s]

表1 三组受检者的一般资料比较[例（%），±s]

组别急性发作期慢性持续期对照组χ2/F/t值P值例数43 37 78男/女（例）23/20 19/18 41/37 0.036 0.982年龄（岁）38.36±12.29 38.94±12.73 38.51±12.16 0.024 0.976 BMI（kg/m2）23.91±5.87 24.12±6.09 24.65±6.74 0.212 0.809吸烟11（25.58）9（24.32）12（15.00）2.280 0.320 ACT评分17.82±1.96 23.04±1.85-12.188 0.001

2.2 三组受检者的血清lncRNA PVT1表达水平比较急性发作期组患者血清lncRNA PVT1表达水平明显高于慢性持续期组和对照组，而慢性持续期组患者的血清lncRNA PVT1表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 三组受检者的血清lncRNA PVT1表达水平比较（±s）

表2 三组受检者的血清lncRNA PVT1表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与慢性持续期组比较，bP＜0.05。

组别急性发作期慢性持续期对照组F值P值例数43 37 78 lncRNA PVT1 4.63±1.52ab 2.37±0.75a 1.02±0.34 221.937 0.001

2.3 三组受检者的气道炎症相关指标比较急性发作期组患者的血清IL-6、IL-17、TGF-β、IgE及血EOS水平明显高于慢性持续期组和对照组，而慢性持续期组患者的上述各项指标明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 三组受检者的气道炎症相关指标比较（±s）

表3 三组受检者的气道炎症相关指标比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与慢性持续期组比较，bP＜0.05。

组别急性发作期慢性持续期对照组F值P值例数43 37 78 IL-6（pg/mL）86.54±22.03ab 69.82±20.36a 53.19±16.05 44.239 0.001 IL-17（ng/L）43.25±13.19ab 23.07±7.29a 17.57±5.65 123.781 0.001 TGF-β（ng/L）347.19±108.01ab 169.58±51.33a 73.62±21.07 259.732 0.001 IgE（kU/L）516.58±147.05ab 273.04±88.21a 57.39±18.52 377.872 0.001 EOS（×109/L）0.67±0.21ab 0.25±0.07a 0.13±0.04 296.391 0.001

2.4 三组受检者的气道重塑及肺功能指标比较与对照组比较，慢性持续期组患者气道重塑指标T/D、WA%水平明显升高，肺功能指标FEV1、FEV1%、PEF水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组和慢性持续期组比较，急性发作期组患者气道重塑指标T/D、WA%水平明显升高，肺功能指标FEV1、FEV1%、PEF水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 三组受检者的气道重塑及肺功能指标比较（±s）

表4 三组受检者的气道重塑及肺功能指标比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与慢性持续期组比较，bP＜0.05。

组别急性发作期慢性持续期对照组F值P值例数43 37 78 T/D 0.45±0.14ab 0.37±0.11a 0.21±0.06 88.538 0.001 WA%67.58±5.73ab 59.64±5.82a 43.61±4.97 301.798 0.001 FEV1（L）1.73±0.45ab 2.56±0.61a 3.04±0.85 47.554 0.001 FEV1%68.22±7.41ab 80.37±9.39a 92.64±12.05 78.591 0.001 PEF（L/s）ab3.72±1.19 a5.34±1.65 7.92±2.26 73.518 0.001气道重塑 肺功能

2.5 支气管哮喘患者血清lncRNA PVT1水平与气道炎症、重塑指标的相关性急性发作期组和慢性持续期组患者血清lncRNA PVT1水平均与IL-6、TGF-β、T/D、WA%水平呈正相关（P＜0.05），与FEV1、FEV1%水平呈负相关（P＜0.05），见表5。

表5 支气管哮喘患者血清lncRNA PVT1水平与气道炎症、重塑指标的相关性

3 讨论

支气管哮喘患者早期出现短暂性呼吸困难、胸闷、咳嗽、呼吸时反复喘息等症状。若早期症状不能得到有效缓解，支气管哮喘易进展至急性发作期，多数患者表现为喘息、气促、胸闷、咳嗽等突然发生并持续加重，目前只能通过药物缓解病情进展或自行缓解，而不能完全治愈[7]。有研究表明，ACT评分可反映支气管哮喘患者病情控制水平[8]。本研究结果显示，急性发作期组患者ACT评分明显低于慢性持续期组患者，与王鸿雁等[8]研究结果一致。

lncRNA是一种长度大于200 nt的具有疾病调控功能的非编码RNA。有研究表明，lncRNA生长阻滞特异性转录本5水平异常可影响气道平滑肌细胞和气道上皮细胞炎症反应，促进支气管哮喘等慢性气道疾病发病和持续进展[9]。ZHANG等[10]研究发现，lncRNA脑细胞质RNA1在模型哮喘大鼠中表达上调，通过增大气道平滑肌活性发挥其致病作用。提示lncRNA可能参与支气管哮喘发生发展。有研究报道，支气管哮喘患者气道平滑肌细胞中lncRNA PVT1表达水平上调，与疾病严重程度有关[11]。本研究结果显示，对照组、慢性持续期组、急性发作期组血清lncRNA PVT1表达水平依次显著升高，与AUSTIN等[11]研究结果相似，提示血清lncRNA PVT1表达水平升高可能预示支气管哮喘发生、发展。

有研究表明支气管哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-17、TGF-β、IgE、EOS水平显著高于对照组，下调其表达可缓解模型小鼠气道炎症[12-13]。本研究结果显示，血清IL-6、IL-17、TGF-β、IgE及血EOS水平在对照组、慢性持续期组和急性发作期组依次显著升高，与前人研究结果基本一致，提示支气管哮喘患者气道炎症水平随病情加重而升高[12-13]。常琴等[14]研究发现，气道重塑可导致支气管哮喘患者不可逆性气流受限。本研究结果显示，对照组、慢性持续期组和急性发作期组气道重塑指标T/D、WA%水平依次显著升高，肺功能指标FEV1、FEV1%、PEF水平依次显著降低，提示支气管哮喘患者存在不同程度的气道重塑和肺功能损伤。

HUANG等[15]在感染性急性肾损伤研究中发现，lncRNA PVT1可通过诱导IL-6等炎症因子表达，促进炎症反应。WANG等[16]研究报道，沉默宫颈鳞癌细胞中lncRNA PVT1可抑制癌细胞增殖，减少TGF-β表达。本研究结果发现，急性发作期组和慢性持续期组患者血清lncRNA PVT1水平均与IL-6、TGF-β水平呈正相关，提示血清中lncRNA PVT1与IL-6、TGF-β可能存在一定相互作用，共同参与支气管哮喘患者气道炎症进展。HUR等[17]研究发现，下调哮喘模型小鼠肺成纤维细胞TGF-β表达时，气道高反应和气道重塑杯状细胞增生受到抑制，哮喘症状减轻。有研究报道，慢性阻塞性肺疾病患者血清TGF-β水平越高，FEV1越低，TGF-β可在一定程度上反映患者肺功能水平[18]。本研究结果显示，急性发作期组和慢性持续期组患者血清lncRNA PVT1水平均与气道重塑指标T/D、WA%水平呈正相关，与肺功能指标FEV1、FEV1%水平呈负相关，提示lncRNA PVT1可能通过上调TGF-β表达，促进支气管哮喘患者气道重塑和诱导肺功能损伤。上皮间充质转化过程与支气管患者气道重塑密切相关[3]。ZHANG等[19]研究发现，lncRNA PVT1通过上调E-钙黏蛋白、β-连环蛋白等上皮标记蛋白及TGF-β表达，促进胰腺癌细胞生长和上皮间充质转化。提示，lncRNA PVT1可能通过调控TGF-β水平，促进上皮间充质转化，影响支气管哮喘发生发展。

综上所述，与对照组相比，慢性持续期组、急性发作期组患者血清lncRNA PVT1表达水平显著升高，与IL-6、TGF-β等气道炎症指标和T/D、WA%等气道重塑指标呈正相关，与FEV1、FEV1%等肺功能指标呈负相关。血清lncRNA PVT1可能作为生物标志物，预示支气管哮喘患者气道炎症和气道重塑水平，可能对临床评估患者病情和确定治疗方案有一定帮助。但由于本研究样本量较少，相关机制探寻尚需进一步纳入更多样本量、进行大量实验研究。