长链非编码RNA在肝癌诊断中的作用

徐 鲁 冯家立 沈 昕

湖北中医药大学检验学院 (湖北 武汉， 430000)

近年来肝细胞癌(HCC)在世界范围内发病率呈上升趋势，WHO认为肝癌给中国带来的社会和经济负担在所有肿瘤中排名第一[1]。HCC目前主要的有效治疗方式是手术切除和肝移植。随着医学技术的发展，HCC患者的生存质量日益提高，但术后肿瘤复发仍然严重影响HCC患者的预后。HCC病程进展快且预后差，患者确诊时多为中晚期，失去了治疗的最佳时机，因此HCC的早期诊断对患者的治疗和预后意义重大。甲胎蛋白(AFP)是常用的HCC诊断标志物之一，研究显示约50%的HCC患者血清中可检测到AFP，目前已经发现AFP在部分患者中并不升高[2]。因此，AFP对于HCC的诊断有一定的漏诊，寻找HCC的新型标志物对提高HCC诊断的灵敏度和特异性意义重大。近年来长链非编码RNA(lncRNA)受到越来越多的关注，本文就lncRNA的功能以及在HCC诊断中的作用做一综述。

1 lncRNA简介

1.1 lncRNA的来源与分类 lncRNA是一类转录本长度为200 nt～100 kb的无编码功能的RNA分子。lncRNA起初被认为是一种几乎没有功能的转录序列[3]，然而随后的研究揭示了lncRNA在各种细胞过程中的重要作用，包括参与基因的转录、细胞内转染和染色体重塑等功能[4,5]。目前根据lncRNA与mRNA的相似性，推测lncRNA的可能来源如下。①编码蛋白质的结构基因由于开放读码框架(ORF)突变导致核苷酸序列断裂；②染色质重排；③非编码基因转录；④基因中插入一个转座成分而产生；⑤lncRNA部分序列重复形成[6,7]。根据编码基因在基因组中的位置，lncRNA可分为正义、反义、双向、基因间及基因内5大类型。

1.2 lncRNA的功能 lncRNA的调控功能主要通过与DNA、RNA或蛋白质分子相互作用来实现。在细胞内，lncRNA通过广泛调节DNA甲基化、组蛋白修饰和染色体重构从而调节基因的表达。DNA甲基化被证明与许多肿瘤的发生相关，许多抑癌基因的启动子CPG岛发生甲基化后，使得抑癌基因无法转录，进而导致肿瘤的发生[8]。真核细胞的转录过程需要多种蛋白因子的辅助，转录因子与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。lncRNA通过一系列的顺式调节和反式作用来影响DNA信息的转录和翻译。Yang等[9]的研究发现，lncRNA PRNCR 1和PCGEM 1与前列腺癌细胞表面雄激素受体结合增强配体依赖和非配体依赖的雄激素受体激活通路从而导致前列腺癌细胞增殖。lncRNA还可与靶mRNA序列互补配对，从而影响mRNA的拼接、编辑、运输、翻译和降解过程[10]。

在肿瘤细胞中，lncRNA可维持细胞的生长与增殖，促进转移和肿瘤的侵袭，诱导血管的形成，抑制细胞的凋亡，还可影响肿瘤的代谢。研究显示，肿瘤的浸润转移以及血管形成的过程通常伴随着lncRNA表达的改变，这说明lncRNA可以通过调控这些过程进而影响肿瘤的代谢变化[11]。

2 lncRNA与肝癌

2.1 与肝癌细胞增殖相关的lncRNA 肝癌高表达转录本(HULC)位于染色体6p24.3， HULC的表达可以影响肿瘤抑制基因p18启动子的活性，并影响p18蛋白的表达，从而影响p18抑制细胞过度生长，促进肝癌细胞的增殖[12]。URHC通过调控ZAK蛋白的表达从而促进肝癌细胞的增殖，研究发现URHC与预后不良相关[13]。有研究发现有56种超保守RNA(ucRNA)在肝癌细胞系中表达异常，其中uc.338在肝癌组织中表达升高[14]。

2.2 与肝癌细胞凋亡相关的lncRNA 母本印迹表达基因3(MEG3)在4种肝癌细胞系中表达下调，RNA原位杂交显示在肝癌组织中MEG3杂交信号弱或缺失，而在正常肝组织中信号强烈，MEG3抑制细胞增殖、与肝癌细胞的凋亡有相关性[15]。uc002mbe.2对组蛋白去乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)介导的肝细胞凋亡中发挥作用，研究发现肝癌细胞系中uc002mbe.2的表达低于正常肝脏细胞系[16]。

2.3 与肝癌预后和转移相关的lncRNA lncRNA MVIH与血管形成有关，新生血管形成利于癌细胞生存，且方便癌细胞转移，lncRNA MVIH在肝癌中高表达，与患者的生存率低密切相关[16]。lncRNA ATB在肝癌细胞中表达上调，lncRNA ATB与微血管和大血管的转移关系密切，lncRNA ATB与miR-200家族结合使miR-200家族对基因ZEB1、ZEB2的抑制作用变弱，导致ZEB1蛋白和ZEB2蛋白的表达上调，诱导上皮间质转化，从而使肿瘤细胞的侵袭能力增强[17]。lncRNA LET在肝癌患者肝组织中表达下调与肿瘤的微转移有显著相关性[18]。lncRNA HOTAIR 高表达的患者易淋巴结转移、复发风险增高、影响生存率[19]。

2.4 与HBV感染相关的lnc RNA lncRNA HEIH(lncRNA high expression in HCC)对HBV相关的肝癌进展有作用，在肝癌组织中表达高于非癌肝组织，表达HEIH高的患者预后比表达HEIH低的患者差，HEIH高表达与肝癌复发的相关性高，HEIH可作为评判肝癌患者生存率的预后指标[20]。lncRNA Dreh高表达组的复发率比低表达组的复发率低，生存期延长明显，Dreh与肝癌患者预后有相关性[21]。

2.5 与肝癌耐药相关的lncRNA lncRNA H19可以诱导P-糖蛋白的表达引起MDRI相关的耐药[22]。lncRNA CUDR在肝癌细胞系HepG2中高表达，由CUDR基因编码且与化疗药物的耐药有相关性，研究发现CUDR表达的下调使得肿瘤细胞易对化疗药物产生耐药[23]。

3 lncRNA在肝癌诊断与预后中的应用

肝癌的预后与癌症的临床分期息息相关，提高肝癌的早期诊断率可以降低肝癌的死亡率，改善患者的预后。大多数早期肝癌没有明显的临床症状，当发现临床症状时，肿瘤细胞往往已经出现转移或侵犯周围组织，临床预后往往很差，患者生存率较低。基于目前的诊断手段，早期肝癌的诊断率并不高。早期较小的肿瘤病灶一般的影像学手段往往无法发现。研究表明，在早期肝癌患者中，只有10%～20%的患者出现AFP异常[24,25]。在2011年欧洲肝病协会发布的临床指南中不再使用AFP作为诊断指标[26]。近年来虽然有一些新的肝癌诊断指标应用于临床，如异常凝血酶原(DCP)，提高了肝癌的诊断效果，但是这些标志物也存着一定的局限性。随着lncRNA研究特别是lncRNA与肝癌关系的研究的进展，越来越多的lncRNA被发现可用于肝癌的诊断。

3.1 单一lncRNA应用于肝癌的诊断 单一的lncRNA应用于肝癌的诊断表现出较高的诊断效能。多位研究者发现UCA1在诊断肝癌中有较高的诊断效能。Zheng等[27]的一项包含105例HCC患者、105名健康志愿者以及105例良性肝病患者的研究中发现，但选择UCA1截断值为1.85时在健康人群和HCC患者中鉴别出HCC患者的灵敏度为73.3%，特异性为99.0%，ROC曲线下面积为0.902，这说明UCA1在肝癌的筛查中具有较高的特异性。研究还发现在区分良性肝病和HCC患者时，UCA1同样也表现出较好的诊断效能。EL-Tawdi等[28]的研究也得出了类似的结论，值得注意的是EL-Tawdi还研究了UCA1应用于区分慢性丙型肝炎患者和HCC患者时的诊断价值，发现UCA1也具有较高的诊断效能(AUC=0.838)。Wang等[29]对lncRNA GAS5-AS1的研究发现，下调的GAS5-AS1与肝癌的发生相关，并表现出作为肝癌诊断标志物的潜力，进一步的研究发现GAS5-AS1在区分HCC与肝硬化方面具有较高的准确度(AUC=0.824)，当区分AFP<200 ng/ml 的HCC病例与AFP<200 ng/ml的肝硬化病例以及区分AFP<200 ng/ml 的HCC病例和乙型肝炎病例时，GAS5-AS1具有较高的灵敏度(分别为89.5%和89.5%)，表明GAS5-AS1可能是HCC的潜在诊断标志物。此外，还有许多学者研究了其他lncRNA作为肝癌诊断标志物的可能，例如MALAT1、SHNG1、Lnc-PCDH9-13∶1，这些lncRNA都表现出较好的诊断价值[30-32]。值得一提的是，Xie等[31]的研究样本为唾液，发现唾液中的Lnc-PCDH9-13:1在区分HCC患者和健康人群具有较高的特异性和AUC面积(特异性为98%，AUC=0.898)。唾液标本留取简单，值得进一步研究。

3.2 多种lncRNA联合检测应用于肝癌的诊断 有些lncRNA单独应用于肝癌的诊断时，其诊断效能表现不够出色，但多种lncRNA联合检测往往可以提高诊断效能。包含3种血浆lncRNA的组合(LINC00152、RP11-160H22.5和XLOC014172)可能是区分HCC患者和健康人群以及慢性肝炎患者的指标[33]。另一项研究使用了血浆RP11-160H22.5、XLOC_014172、LOC149086作为lncRNA组合，这项研究包含147例HCC患者和180例健康人员，但选择7.449为截断值时ROC曲线下面积最大(AUC=0.896)，诊断特异性为82%，灵敏度为73%，具有较好的诊断效能[34]。Wang等[35]选择测定血清uc001ncr和AX800134作为lncRNA组合，在区分早期乙型肝炎病毒相关性肝癌(BCLC分级别为0+A)和乙型肝炎患者以及健康人群表现出极高的诊断价值，灵敏度为81.08%，特异性为90.91%，ROC曲线下面积为0.9564，但其研究的早期肝癌患者数量较少，结果的准确性有待进一步的验证。

3.3 lncRNA联合AFP或者其他指标检测应用于肝癌的诊断Konishi等[30]在同一病例组和对照组中分别评估了血浆lncRNA MALAT1、AFP、维生素K缺乏诱导蛋白Ⅱ(PIVKAⅡ)以及三者联合使用时区分HCC患者和肝病患者的诊断效能发现，当三者联合使用时灵敏度特异性明显提高。同样的研究结论也出现在Xu等[36]的研究中，当ENSG00000258332.1、LINC00635、AFP联合使用时达到最大的灵敏度特异性。Wang等[29]发现血清lncRNA LRB1联合异常凝血酶原(DCP)与LRB1联合AFP相比在区分HCC患者和健康人群是具有更高的灵敏度特异性和ROC曲线下面积，但三者联用的诊断效能更高；三者同时联用时，区分早期HCC患者(TNM分级为Ⅰ～Ⅱ级)和健康人群相较于区分HCC和健康人群具有更高的诊断效能，这表明联合检测LRB1、AFP和DCP更加有助于早期肝癌的发现。

3.4 lncRNA与肝癌的预后 虽然lncRNA被人们熟知并进行深入研究的时间不长，但已有很多研究发现lncRNA与肝癌患者的预后相关。Wang等[37]的一项研究发现，采用lncRNA表达芯片和逆转录定量聚合酶链反应分析检测326例HCC患者和73例健康志愿者LRB1的表达水平，分析LRB1表达与临床参数的关系。结果表明，与健康志愿者相比，HCC患者血清LRB1水平显着升高。血清LRB1水平与甲胎蛋白表达、肿瘤大小、肿瘤分期和静脉侵袭呈正相关，与总生存呈负相关。Zeng等[38]的研究发现，lncDQ在HCC组织样本和血清中均上调，并且与低存活率和不利的临床病理特征相关。多变量分析表明lncDQ表达是HCC的独立预后因素。Ma等[39]的一项研究通过定量逆转录-PCR(qRT-PCR)评估68个HCC组织和邻近正常组织中的JPX和XIST表达，分析了它们与病理特征和总体存活率的关系。结果表明，JPX和XIST水平在HCC中显着降低，并且与组织学分级和肿瘤TNM分期相关。低JPX和XIST表达导致HCC的总体存活率显着降低。多变量回归分析表明，JPX / XIST表达水平是HCC总体存活率的独立预后因素。

4 小结与展望

尽管lncRNA在肝癌诊断中表现出令人振奋的结果，但是也存在着许多问题。lncRNA的研究正处于起步阶段，其作用机制尚不清楚。另外，lncRNA的作用靶点众多，完整阐明某个lncRNA的调控网络较为困难。lncRNA的研究目前较为分散，尚未有特定的lncRNA与肝癌相关性的系统研究。虽然，有研究报道了lncRNA在肝癌诊断中具有独特的优势，但是这些lncRNA应用于临床还需要更多的研究。在lncRNA对肝癌患者的预后方面，尽管多数研究都发现lncRNA的表达上调或下调与肝癌的预后相关，但这些lncRNA是如何影响肝癌的预后并不十分清楚。随着基因技术的发展，lncRNA作为疾病的诊断预后标志物是大势所趋，高通量的测序方法以及非侵入性的检测手段也需要在今后的研究中发现。