消糖灵片的超高效液相色谱指纹图谱建立、含量测定 及化学模式识别

王素娟，贺凡珍，王乾蕾，李哲，许润娟（中山市食品药品检验所，广东 中山 528437）

消糖灵片是临床常用的降糖类药物，由11味中药（知母、天花粉、黄连、白芍、黄芪、人参、枸杞子、丹参、五味子、杜仲及沙苑子）与西药格列本脲组成，具有益气养阴、清热泻火、益肾缩尿之功效，临床上用于治疗阴虚燥热、气阴两虚所致的消渴病，症见口渴喜饮、体倦乏力、多食、多尿、消瘦；2型糖尿病见上述症候者[1]。消糖灵片质量标准收载于国家食品药品监督管理局新药转正标准第七十六册（标准号为YBZ03442004-2008Z），原质量标准对黄芪甲苷、人参皂苷Re和人参皂苷Rg1、黄连药材进行了薄层鉴别，并对芍药苷与格列本脲进行了含量测定。但仅对部分药味进行薄层色谱鉴别和含量测定，无法全面反映产品的质量。目前尚未见有消糖灵片化学成分与指纹图谱的相关研究报道[2-3]。 中药复方制剂由多味中药材共同配伍而成，通过不同活性成分共同作用达到治疗疾病的目的，因此对中药复方制剂质量控制的方法应能够更加客观、全面地反映其所含的化学成分。中药指纹图谱能标示中药的化学成分特征，通过对其潜藏的大量数据和变量进行挖掘和评价，能够有效反映出中药内在的化学成分信息[4-5]，实现鉴别产品真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可靠手段[4-5]。因此，本试验旨在建立消糖灵片的UPLC指纹图谱，并进行多组分含量测定，结合化学模式识别方法对所得数据进行综合分析，为消糖灵片的质量评价和控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC H-CLASS 超高液相色谱仪，PDA检测器（美国沃特世公司）；Millipore Integral-5超纯水机（德国默克公司）；METTLER XS 205电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多）；超声波清洗机（天津瑞普）。

1.2 试药

15批消糖灵片样品（7批由广东先通药业有限公司提供，8批购自市场），具体信息见表1。对照品绿原酸（批号：110753-201817，含量：96.8%）、芒果苷（批号：111607-201704，含量：98.1%）、芍药苷（批号：110736-201943，含量95.1%）、盐酸黄连碱（批号：112026-201802，含量：94.0%）、盐酸巴马汀（批号：110732-201913，含量：85.7%）、盐酸小檗碱（批号：110713-201814，含量：86.7%）、五味子醇甲（批号：110857-201815，含量：99.7%）、格列本脲（批号：100135-201806，含量：99.5%，HPLC）（中国食品药品检定研究院）；对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：PF190926-15，含量：98.87%）、沙苑子苷（批号：PF190618-05，含量：98.56%）、丹酚酸B（批号：PF191019-03，含量：98.66%）（Stanford Chemicals公司）；对照品芍药内酯苷（批号：O0970010，含量：99.4%，上海安谱实验科技股份有限公司）。乙腈、甲醇为色谱纯（MERCK公司），超纯水由Millipore超纯水机制备。

表1 消糖灵片样品信息 Tab 1 Samples of Xiaotangling tablet

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%磷酸水（加1 mL三乙胺调pH至2.6）（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，98%～84%A；10～14 min，84%～77%A；14～22.5 min，77%～70%A；22.5～33 min，70%～30%A；33～36 min，70%A）；体积流量0.2 mL·min－1；柱温30℃；进样量2 μL，检测波长230 nm。

2.2 消糖灵片UPLC指纹图谱的建立

2.2.1 指纹图谱对照品溶液的制备 分别精密称取对照品（绿原酸、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、沙苑子苷、盐酸黄连碱、丹酚酸B、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、五味子醇甲、格列本脲）各约5 mg，加甲醇溶解定容于10 mL量瓶中，配制成质量浓度约为0.5 mg·mL－1的对照品储备液；分别精密量取2 mL，置同一50 mL量瓶中，用50%甲醇水溶液稀释定容至刻度，制成质量浓度约0.02 mg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取消糖灵片10片，除去薄膜衣，研细，混匀，精密称取0.4 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇水溶液25 mL，密塞，超声处理（40 kHz）30 min，取出，放冷，用50%甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 精密度试验 精密吸取样品 S6 供试品溶液6份，进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间RSD小于1.0%，相对峰面积RSD值在0.20%～2.9%。表明仪器精密度良好。

2.2.4 重复性试验 精密称取样品 S6共6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，测得各共有峰相对保留时间RSD小于1.0%，相对峰面积RSD值在0.52%～2.9%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 在“2.1”项条件下，分别于0、2、4、6、12、24 h精密吸取样品 S6 供试品溶液进样，测得各共有色谱峰相对保留时间RSD小于1.0%，相对峰面积RSD值在0.38%～2.4%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.6 指纹图谱建立及相似度分析 使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.1版本）对所得的不同批次消糖灵片的指纹图谱数据进行分析，以S6为参照色谱图，采用多点校正法建立指纹图谱[6]，得到15批消糖灵片指纹图谱见图1，相似度计算数据显示，15批消糖灵片样品的指纹图谱相对于对照指纹图谱（R）的相似度均大于0.996，结果见图2。

图1 15批样品UPLC指纹图谱Fig 1 UPLC fingerprints of 15 batches of samples

图2 15批样品相似度计算结果Fig 2 Similarities of 15 batches of samples

2.2.7 色谱峰指认 在消糖灵片UPLC指纹图谱中共标定25个共有峰，通过与混合对照品溶液图谱的峰保留时间及光谱图对照，分别指认了12个色谱峰。其中4号峰为绿原酸，5号峰为芒果苷，8号峰为芍药内酯苷，10号峰为芍药苷，11号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，14号峰为沙苑子苷，17号峰为盐酸黄连碱，18号峰为丹酚酸B，19号峰为盐酸巴马汀，20号峰为盐酸小檗碱，23号峰为五味子醇甲，25号峰为格列本脲，结果见图3。

图3 混合对照品溶液的UPLC色谱图Fig 3 UPLC chromatography of mixed reference substances

2.3 7种组分的含量测定

2.3.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取对照品（盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、芒果苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲）各适量，分别置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成各对照品储备液；分别精密取各对照品储备液适量，加50%甲醇水溶液制成盐酸小檗碱质量浓度分别为11.319、22.639、45.279、90.558、181.116 μg·mL－1，盐酸黄连碱质量浓度分别为8.800、17.601、35.203、70.406、140.812 μg·mL－1，芒果苷质量浓度分别为0.8497、1.699、3.399、6.798、13.596 μg·mL－1，芍药苷分别为4.454、8.909、17.82、35.64、71.28 μg·mL－1，毛蕊异黄酮葡萄糖苷分别为2.236、4.472、8.944、17.89、35.78 μg·mL－1，五味子醇甲分别为0.7415、1.483、2.966、5.932、11.86 μg·mL－1， 格列本脲分别为3.783、7.567、15.13、30.15、60.54 μg·mL－1的混合系列对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 同“2.2.2”项下操作。

2.3.3 系统适用性试验 取混合对照品溶液、供试品溶液（编号S6）和空白溶液（50%甲醇水溶液）适量，进样测定，记录色谱图。结果各待测成分的色谱峰分离度均大于1.5，理论板数均大于80 000，拖尾因子为0.9～1.4，空白溶液对7种成分的测定无干扰，见图4。

图4 供试品（A）、混合对照品（B）和空白溶液（C）色谱图Fig 4 UPLC chromatogram of Xiaotangling tablets（A），mixed reference（B）and blank solution（C）

2.3.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.1”项下各混合系列对照品溶液，进样测定，记录色谱图。以各待测成分质量浓度（X，μg·mL－1）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表2。

表2 7种组分的回归方程与线性范围 Tab 2 Regression equation and linearity of 7 components

2.3.5 精密度试验 取“2.3.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、芒果苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲峰面积的RSD分别为0.060%、0.10%、0.35%、0.20%、0.26%、2.0%、0.21%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 取消糖灵片样品（编号S6）0.4 g，共6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品含量。结果7种成分峰面积的RSD在0.52%～2.3%，表明方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 取“2.3.2”项下供试品溶液（编号S6）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、12、24 h，进样测定，记录峰面积。结果7种成分峰面积的RSD在0.38%～2.3%。

2.3.8 加样回收试验 取已知含量的消糖灵片样品（编号S6）约0.2 g，共9份，分别按已知含量的80%、100%、120%加入7种对照品储备液（各3份），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、芒果苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲的平均加样回收率分别在96.11%～101.06（RSD在0.27%～1.1%）、94.96%～96.46%（RSD在0.32%～0.82%）、98.60%～103.74%（RSD在1.1%～1.4%）、94.53%～99.10%%（RSD在0.23%～0.58%）、98.45%～99.97%（RSD在0.63%～2.1%）、95.17%～97.27%（RSD在1.1%～1.9%）、98.81%～100.9%（RSD在0.41%～1.3%）。

2.3.9 样品含量测定 取消糖灵片15批，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品含量。测得样品中盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、芒果苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲的含量分别在3.951～4.356、1.325～1.665、0.205～0.331、2.444～3.119、0.184～0.296、0.264～0.380、1.598～1.786 mg·g－1，结果见表3。

表3 15批消糖灵片中7个成分含量的测定结果(n＝3，mg·g－1) Tab 3 Content of 7 components in 15 batches of Xiaotangling tablets (n＝3，mg·g－1)

2.4 化学模式识别方法

2.4.1 聚类分析（CA） 应用SPSS 20.0软件，以共有峰的相对峰面积为变量，对消糖灵片样品的数据进行聚类分析，采用组间平均连接法，以欧氏距离为度量标准[7]，结果见图5。当距离刻度为25时，15批样品主要分为2大类，S2、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S11、S13、S14、S15为第1类，S1、S4、S10、S12为第2类。

图5 15 批样品聚类树状图Fig 5 Dendrogram of cluster analysis of 15 batches of samples

2.4.2 主成分分析（PCA） 以各批次消糖灵片的指纹图谱所得共有峰的峰面积为变量，构建15×25的原始数据矩阵，通过变量统计分析软件（SIMCA 14.1）对15批消糖灵片样品进行PCA，绘制出主成分分析图，结果见图6，表明15批消糖灵片样品呈现的分类与聚类分析结果基本吻合。PCA载荷图中的每一个点表示为一个色谱峰，其与原点（0，0）的距离越远，代表该色谱峰对样品整体分布贡献的程度越大[8]。3、4、5、6、10、11、12、13、14、16、17、19、20、22和25号色谱峰在坐标系中距离原点较远，表明其对消糖灵片的质量有重要影响，见图7。

图6 15 批样品PCA图Fig 6 PCA plot for 15 batches of samples

图7 15 批样品PCA载荷图Fig 7 Load scatter diagram of 15 batches of samples

2.4.3 OPLS-DA 本研究采用OPLS-DA模型对样品的数据进一步分析，得到各批次样品间的差异性成分，见图8。

图8 15批样品OPLS-DA分析散点图Fig 8 Scatter diagram of OPLS-DA of 15 batches of samples

为筛选出对上述样品分类贡献较大的成分，以变量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）＞1.0 为筛选标准[9]，对数据进行处理分析。共得到10个有意义变量，按照变量投影重要度值大小依次为13号峰＞17号峰（盐酸黄连碱）＞20号峰（盐酸小檗碱）＞16号峰＞2号峰＞18号峰（丹酚酸B）＞25号峰（格列本脲）＞5号峰（芒果苷）＞10号峰（芍药苷）＞11号峰（毛蕊异黄酮葡萄糖苷），结果见图9。这些成分是导致15批样品之间差异的主要原因，有一定的标志作用，该结果与PCA中载荷图的分析结果基本一致。在以后对消糖灵片的研究中可以重点关注上述成分的质量变化，以便更加系统、高效地评价药物质量。

图9 15批样品各成分VIP图Fig 9 VIP diagram of various constituents from 15 batches of samples

3 讨论

3.1 提取条件的优化

本研究在制备消糖灵片UPLC供试品溶液时，结合处方工艺和各组分化学性质[10-15]，曾分别采用超声（15、30、60 min）、加热回流（60、80、100℃）的方式进行提取，并进行了提取溶剂的筛选（不同比例的甲醇水溶液、乙醇水溶液等）。结果显示，加热回流提取耗时长，并且温度高于80℃时提取60 min，格列本脲有降解。50%甲醇水溶液超声提取所得色谱峰信息最多，更能兼顾各药材所含化学成分，最终选择50%甲醇超声30 min进行提取。

3.2 色谱条件的优化

分别对流动相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸水、乙腈-酸水）、色谱柱[ Waters CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）]、体积流量（0.15、0.20、0.25、0.3 mL·min－1）、柱 温（25、30、35℃）、检测波长（210、230、254、280、320 nm）进行考察，综合峰响应强度和数量、基线平稳性、分离度效果，最终确定Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱，乙腈-0.1%磷酸水（加1 mL三乙胺调pH至2.6）梯度洗脱，体积流量0.2 mL·min－1，检测波长230 nm，柱温30℃为色谱分析条件。

3.3 相似度分析与含量测定分析

本研究建立的消糖灵片UPLC指纹图谱，可以反映消糖灵片处方中各味药材所含化学组分的信息。相似度评价结果表明，各批次的消糖灵片指纹图谱具有高度的相似性，即各批样品的化学成分一致性较好。

含量测定成分的选择主要考虑所含的活性成分、君（臣）药的特征成分、处方中大多数药味的提取工艺等情况。消糖灵片中知母、天花粉、黄连为君药；人参、黄芪为臣药；枸杞子、白芍、丹参、五味子为佐药；杜仲、沙苑子为使药。其中君药天花粉的主要有效成分为蛋白质类、多糖类等，均无紫外吸收。其生产工艺中君药黄连、人参采取粉碎为细粉入药，其余药材采用水提醇沉法提取。人参的主要有效成分有人参皂苷类，为脂溶性成分，且最大吸收波长在203 nm，在拟定条件下难以检出。因此选择知母、黄连、黄芪、白芍和五味子的活性成分进行含量测定。盐酸小檗碱、盐酸黄连碱归属于黄连药材，芒果苷归属于知母药材，芍药苷归属于白芍药材，毛蕊异黄酮葡萄糖苷归属于黄芪药材，五味子醇甲归属于五味子药材[10-15]，各组分涵盖君、臣、佐多味药材的有效成分。结果显示，15批消糖灵片中盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、芒果苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲7 种成分含量的RSD分别为 2.5%、7.3%、17.2%、7.4%、12.3%、13.1%、3.7%，表明不同批次的消糖灵片质量存在一定差异，这可能是投料药材质量存在差异所导致的。

3.4 CA与PCA

因目前仅有一个厂家生产消糖灵片，故笔者通过从生产和流通环节总共收集了不同批次的15个样本。按照样品中各成分的含量，在CA与PCA中将15个样本分为两大类。同时OPLS-DA 分析出对分组贡献较大的差异标志物10个，建议生产厂家对这10个标志物进行重点关注，跟踪这些标志物在各生产环节中的变化。本研究建立的指纹图谱、多组分含量测定，结合化学模式识别方法为不同批次的消糖灵片质量一致性提供新思路，能有效弥补现有标准的不足，可供企业在原药材来源、运输储存、生产工艺等各个环节进行监控，以便科学、系统地保证药品的质量。

综上所述，所建立的UPLC指纹图谱稳定、可行，含量测定方法简便、准确、重复性好，结合化学模式识别分析可为消糖灵片的质量控制和质量评价提供参考。