复方黄芪乳膏高效液相色谱指纹图谱的建立及3种成分的测定

刘玉娟，王永洁，郭子右，李婷婷，郝逗逗，梅凯，李鑫，吴清（北京中医药大学 中药学院，北京 102488）

复方黄芪方是针对癌性腹水患者进食差、疼痛而开发的中药外敷方。方中含有黄芪、盐车前子、桂枝等药材，共奏益气温阳、化瘀利水之效，其疗效也在前期的临床观察和相关药理研究中得到验证[1-3]。本课题组结合现代中药制剂研究技术以及各剂型的特点，将本方制成使用方便、性质稳定且药物释放、穿透较快的O/W型乳膏剂，尤其适用于不能口服药物的患者，能有效地减轻患者腹部胀满等不适症状，提高患者的生活质量。

为保证复方黄芪乳膏制剂的质量，需借鉴质量控制新思路对其进行研究[4-7]。近年来，中药指纹图谱的研究多见报道，可评价中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性[8-9]。本研究按照中药指纹图谱研究的技术要求，建立了该制剂HPLC指纹图谱，并同时测定了其中京尼平苷酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸的含量，以期为复方黄芪乳膏的质量标准建立提供参考[10-16]。

1 材料

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪（Thermo，USA）；Mettler AE 240 型十万分之一电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；KQ-500E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

复方黄芪乳膏（批号：20191209，20191210，20191211，20191212，20191213，20191216，20191217，20191218，20191219，20191220，自制）；黄芪（批号：81320901）、红花（批号：73390801）、桂枝（批号：84120901）、大腹皮（批号：81520501）、盐车前子（批号：81440801）、炒牵牛子（批号：80340101）（北京三和药业有限公司）。甲醇、乙腈（色谱级，赛默飞世尔科技公司）；甲酸、磷酸（天津市光复科技发展有限公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

羟基红花黄色素 A（批号：5VRT-PYDB，含量：91.9%）、咖啡酸（批号：X221-42M3，供含量测定用）、毛蕊花糖苷（批号：111530-201713，含量：92.5%）（中国食品药品检定研究院）；京尼平苷酸（批号：Y02A9H57757，含量：98%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：KO1014CB14，含量：98%）、肉桂酸（批号：AA0807DA14，含量：98%）（上海源叶生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent 5 TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，10%～15%A；15～45 min，15%～30%A；45～50 min，30%～35%A；50～80 min，35%～50%A；80～100 min，50%～70%A；100～110 min，70%～90%A）；体积流量0.8 mL·min－1；柱温30℃；检测波长250 nm；进样量10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取各对照品适量，置于量瓶中，75%甲醇定容至刻度，作为储备液，精密吸取适量，加75%甲醇配制成每1 mL分别含京尼平苷酸、羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、咖啡酸、肉桂酸150、90、120、320、260、75 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取各批次复方黄芪乳膏1 g，精密称定于锥形瓶中，加入25 mL75%甲醇，超声处理30 min，放冷后补重，摇匀滤过，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.4 单味药供试品溶液的制备

按处方工艺制得黄芪、红花、盐车前子、大腹皮、炒牵牛子、桂枝单味药提取液，精密吸取各1 mL于5 mL量瓶中，加75%甲醇定容，摇匀，过 0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.5 指纹图谱方法学考察

2.5.1 精密度考察 取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次。以京尼平苷酸为参照峰，结果各共有峰相对保留时间RSD＜0.53%，相对峰面积RSD＜1.9%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性考察 取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件于0、2、4、8、12、24 h进行测定。以京尼平苷酸为参照峰，结果各共有峰相对保留时间RSD＜0.69%，相对峰面积RSD＜1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性考察 取同一批复方黄芪乳膏按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以京尼平苷酸为参照峰，结果各共有峰相对保留时间RSD＜0.83%，相对峰面积RSD＜2.7%，表明方法重复性良好。

2.6 HPLC指纹图谱的建立、相似度评价及共有峰相关分析

2.6.1 指纹图谱的构建 取10批复方黄芪乳膏，按“2.3”项下方法制备供试品溶液并进行分析，得到HPLC色谱图，导入《中药指纹图谱相似度评价系统》（2012 A版）进行色谱峰匹配，生成叠加图及对照指纹图谱，见图1。以1号峰作为参照峰（S），计算相对保留时间。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.48%（见表1），说明出峰时间均较稳定，相对峰面积RSD值均小于7.5%（见表2），表明不同批次的复方黄芪 乳膏质量差异较小。

表1 10批复方黄芪乳膏指纹图谱共有峰相对保留时间 Tab 1 Relative retention time of common peaks in fingerprints of 10 batches of Compound Huangqi cream

表2 10批复方黄芪乳膏指纹图谱共有峰相对峰面积 Tab 2 Relative peak area of the common peaks of the fingerprints of 10 batches of Compound Huangqi cream

图1 10批复方黄芪乳膏指纹图谱（S1～S10）及其对照指纹图谱（R）Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 bathes of Compound Huangqi cream（S1～S10）and common mode of HPLC fingerprints（R）

2.6.2 共有峰的归属与指认 分别取单味药供试品溶液和对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，结果如图2所示。经对照品保留时间定位及色谱峰分析，指认出 6个特征峰，1号峰为京平尼苷酸、6号峰为咖啡酸、8号峰为羟基红花黄色素A、9号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、10号峰为毛蕊花糖苷及17号峰为肉桂酸。其中，1、10、13 号峰来源于盐车前子，2、4、5、6、11、12、14 号峰来源于炒牵牛子，9、15、18号峰来源于黄芪，7、8、16、18号峰来源于红花，17号峰来源于桂枝，3号峰来源于大腹皮。

图2 复方黄芪乳膏共有峰归属Fig 2 Common peaks of Compound Huangqi cream

2.6.3 复方黄芪乳膏指纹图谱相似度评价 将10批复方黄芪乳膏指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版），生成对照指纹图谱并计算相似度，见表3。10批复方黄芪乳膏样品相似度均在0.93～1.00，说明复方黄芪乳膏批次间一致性良好。

表3 复方黄芪乳膏指纹图谱相似度结果 Tab 3 Fingerprint similarity of Compound Huangqi cream

2.7 化学模式识别研究

2.7.1 聚类分析（CA） 采用SAS 8.2软件，以10批复方黄芪乳膏指纹图谱中18个共有峰的相对峰面积为变量，对样品进行系统聚类，见图3。当距离大于6时，10批样品聚为2类，S1、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10为第1类；S2、S3为第2类，说明10批样品只存在细微差异，化学指标成分总体稳定均一，与相似度分析结果相符（10批复方黄芪乳膏样品相似度均在0.93～1.00，S2、S3样品与其他批次样品的相似度较低）。

图3 10批复方黄芪乳膏样品聚类分析结果Fig 3 Cluster analysis of 10 batches of Compound Huangqi cream sample

2.7.2 主成分分析（PCA） 为进一步比较不同批次样品间的质量差异，将10批复方黄芪乳膏中18个共有峰面积导入到SPSS v26.0软件中进行PCA，得出相关矩阵的特征值及其方差，见表4，碎石图见图4。由表4可知，因子1、2、3的特征值分别为11.548、3.808、1.579，累积贡献率是94.084%。同时观察碎石图可见特征值曲线在成分3后存在一个明显的拐点，说明前3个主成分的分析结果基本显示出了不同批次复方黄芪乳膏之间的相似度和差异性。因子载荷矩阵见表5，第1主成分主要反映了来自色谱峰1、2、4、6、7、8、9、10、11、13、15、16、17的 信 息，第2主成分主要反映了来自色谱峰3、5、12、14的信息，第3主成分主要反映了18号色谱峰的信息，故仅用前3个主要成分就可表示原HPLC数据的主要信息。以第 1、2、3 主成分为变量，得到三维投影图，见图5。以X轴为例，1、8、9、17号峰距离原点较远，权重值分别为0.928、0.901、0.858、0.995，表明在复方黄芪乳膏中的作用较大，归属于第1主成分，与上述结果分析

表5 旋转后的因子载荷矩阵 Tab 5 Factor load matrix after rotation

图4 10批复方黄芪乳膏样品因子的碎石图Fig 4 Scree plot of factors of 10 batches Compound Huangqi cream sample

图5 10批复方黄芪乳膏样品旋转后的因子载荷图Fig 5 Factor load diagram after rotation of 10 batches Compound Huangqi cream sample

表4 主成分特征值及方差 Tab 4 Principal component eigen values and variance

2.8 各成分含量测定

2.8.1 线性关系考察 精密量取“2.2”项下京尼平苷酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸对照品储备液适量，用75%甲醇制成20%、50%、100%、200%、300%、400%、500%水平的混合对照品一致，可判定1（京尼平苷酸）、8（羟基红花黄色素A）、9（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、17（肉桂酸）号峰对于研究复方黄芪乳膏批次间一致性具有重要意义。溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表6，可知各成分在各自线性范围内与峰面积线性关系良好。

表6 各成分线性关系 Tab 6 Linearity of various constituents

2.8.2 精密度试验 取“2.8.1”项下100%水平的混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得京尼平苷酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸峰面积RSD分别为0.58%、0.87%、0.24%，表明仪器精密度良好。

2.8.3 稳定性试验 取同一批乳膏（S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，测得京尼平苷酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸峰面积RSD分别为1.3%、1.4%、1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8.4 重复性试验 取同一批乳膏（S1），按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，测得京尼平苷酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸含有量RSD分别为1.4%、2.3%、1.4%，表明该方法重复性良好。

2.8.5 加样回收试验 取已知含量的同一批次乳膏（S1）0.5 g，共6份，精密称定，分别精密加入质量浓度为75.376、58.720、36.840 μg·mL－1的京尼平苷酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸对照品溶液25 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。京尼平苷酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸平均加样回收率分别为103.5%、98.6%、97.2%，RSD分别为1.7%、2.3%、1.9%，表明方法准确度良好。

2.8.6 样品含量测定 取复方黄芪乳膏1 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表7。初步确定，京尼平苷酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸含量分别为1.59～1.84 mg·g－1、1.37～1.58 mg·g－1、0.791～0.943 mg·g－1。

表7 各成分含量测定结果(mg·g－1) Tab 7 Content of various constituents (mg·g－1)

3 讨论

3.1 指标成分确定

复方黄芪方中以黄芪和车前子为君药，桂枝为臣药，发挥益气温阳利水之功效。毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪中的主要药效成分，具有提高免疫力、抗癌等多方面的药理作用，其含量与总黄酮的含量成正相关，可作为质量评价指标[17-19]。京尼平苷酸作为车前子的指标成分之一，其代谢途径和时效与车前子的利尿作用相关[20-21]。桂枝所含化学成分主要为挥发油类，预试验以桂皮醛为指标成分，但其出峰时间及峰面积不稳定，推测与乳膏中其他饮片的成分发生反应或影响洗脱，而肉桂酸含量相对较高且稳定，故选择作为指标成分[22-23]。

3.2 供试品制备方式考察

前期预试验发现，复方黄芪乳膏中含有大量油脂性基质会干扰基线及峰形，因此对不同提取方式（超声法、回流法）、不同提取溶剂（50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇）进行考察，以期减小油脂性基质对蒸散响应信号的影响，达到色谱峰信息量最大化、提取效率最高。最终确定75%甲醇超声提取。随后对超声频率和超声时间进行了考察，在不影响试验结果的条件下，兼顾节能环保的理念，选择超声频率为40 kHz，时间为30 min。

3.3 色谱条件考察

对4种不同型号的色谱柱 Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo BDS Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent 5 XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）及 Wates XBrige C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行考察，发现4种色谱柱分离情况差别较大，最终选择基线平稳、色谱峰较多且峰形、分离效果较好的 Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。

本方药味较多，化学成分复杂且含有酚羟基和羧基等基团。为了有效地分离各成分，以缓冲盐溶液和有机相进行梯度洗脱。考察了甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流动相对指纹图谱的影响，结果表明以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相，所得指纹图谱峰形、分离效果较好，因此选用该体系。

指纹图谱的波长选择时，采用PDA检测器进行190～450 nm全波长扫描，每隔20 nm 提取1个波长进行对比，结果显示在250 nm波长下色谱峰较多，响应值较高信息较完全，因此选用250 nm作为指纹图谱检测波长。