黄连解毒颗粒对靶动物鸡的安全性试验

丁倚晴，李树鹏，练家乐，刘梦杰，刘 举，李子良，雍 燕，刘 翠，郭世宁*

(1.华南农业大学，广东省兽用中药与天然药物工程技术研究中心，广州 510642；2.恩平基龙实业有限公司，广东江门 529400；3.广东温氏大华农生物科技有限公司，广东云浮 527400)

黄连解毒颗粒处方源于《中华人民共和国兽药典》中的黄连解毒散(由黄连、黄芩、黄柏、栀子四味中药组成)，被视为清热解毒的代表方，主治三焦热盛之证[1]。临床可用于治疗猪的高热综合征、仔猪黄白痢、非典型新城疫和大肠杆菌混感等[2]。

黄连解毒散由大苦大寒的黄连等组成，其适口性很差，在临床应用时往往会导致猪等味觉敏感动物采食下降，用药剂量难以得到准确控制，影响疾病的防控效果。此外，中药散剂仅是将药材粉碎成细粉，但有效成分仍存留在细胞壁中，其在动物体内发挥作用时，有效成分的溶出程度和速度亦将影响药效[3]。散剂采用拌料给药，消耗更多人力物力，不如饮水给药方便快捷、成本低。综合上述因素，将黄连解毒散经过提取后制成水溶性的黄连解毒颗粒，将解决目前黄连解毒散的不足，提升药效且便于临床使用[4-5]。

本试验按照中华人民共和国农业农村部《畜禽用药物靶动物安全性试验指导原则》[6]要求测定了黄连解毒颗粒对靶动物鸡的安全性，旨在为今后黄连解毒颗粒新药申报和临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 黄连解毒颗粒由广东温氏大华农生物科技有限公司动物保健品厂生产。规格：每1 g相当于原药材1 g，每袋100 g，生产批号: 20190101。

1.2 试验动物 1日龄黄羽肉雏鸡100只(31.12±0.75 g)：饲养于广东江门恩平基龙实业有限公司，试验期间严格按照管理标准进行饲养。

1.3 仪器设备 AUX-120电子天平为日本岛津产品。BS-380全自动生化分析仪为深圳迈瑞公司产品。微量移液器为德国Eppendorf公司产品。ST16R高速冷冻型离心机购自德国Thermo公司。CX31RTSF型生物显微镜购自日本OLYMPUS公司。TP020型组织脱水机，RM2235型石蜡包埋机、切片机均为德国Leica公司产品。

1.4 主要试剂 苏木素染色液、伊红染色液、中性树胶均购自Solarbio公司。其他如PBS缓冲液、福尔马林溶液为自行配制。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素(UREA)试剂盒均购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.5 动物分组与处理 适应性饲养一周后，根据《兽用中药、天然药物临床试验技术指导原则》中对靶动物安全试验的分组要求，选取健康活泼的雏鸡 80 只，随机分为四组，每组 20 只。根据该药物剂量筛选试验推荐的临床给药剂量，设置黄连解毒颗粒推荐剂量的1倍剂量组(3 g/L)、3倍剂量组(9 g/L)、5倍剂量组(15 g/L)。3个用药组持续饮水给药7 d；对照组饮水中不添加任何药物。

2 观察和测定指标

2.1 临床观察、血常规和血液生化指标测定 每日观察各组试验鸡只精神状态、采食情况、行为表现、粪便、呼吸情况，对异常情况进行记录。分别于给药前和停药后第7天，逐只称重，同时记录饲料消耗量。于给药前、给药第7天及停药后第7天，每组随机选取8只鸡经翅下静脉采血，测定血常规及血生化指标。

采用人工血球计数法及比色法进行血常规的检测：白细胞数目(WBC)、红细胞数目(RBC)、血红蛋白数目(HGB)。血液生化指标的检测：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素(UREA)。

2.2 剖解变化、病理组织观察和脏器系数测定 试验期间出现与药物有关的临床症状或生理生化指标明显异常的动物均屠宰并进行尸体解剖学检查，对异常的器官均进行系统的组织病理学检查；如果未见异常的试验，在停药后第7天，各组试验鸡随机选取8只于采血后进行剖检，观察心、肝、脾、肺、肾、法氏囊等主要脏器的病理变化，采集各脏器并称重，计算脏器系数；同时取对照组和5倍剂量组脏器，经福尔马林固定后，进行组织病理学观察。

2.3 数据统计与分析 所有试验数据用EXCEL软件进行处理后，采用SPSS 24.0统计软件进行One-Way ANOVA分析，比较试验在给药前、给药第7天、停药后第7天，三个试验组与空白对照组间各指标差异显著性，试验数据的结果以“平均数±标准差”(Mean±SD)表示，组间数据差异性采用单因素方差分析。

3 结果与分析

3.1 临床表现 试验期间，黄连解毒颗粒各剂量组和对照组试验鸡，活泼好动，采食、饮水及粪便均正常，未发现死亡病例和受试药物相关的不良反应。

3.2 生长性能变化 由表1 可知，空白对照组、1倍推荐剂量组、3倍推荐剂量组、5倍推荐剂量组在平均日采食量、平均日增重量、料重比相互间无显著差异(P>0.05)。

表1 各组鸡的平均日采食量、平均日增重、料重比Tab 1 Average daily feed intake, average daily weight gain and feed-weight ratio of chickens in each group

3.3 给药前、给药第7天及停药后第7天血常规指标 结果(表2)表明，给药前、给药第7天，黄连解毒颗粒各剂量组的WBC、RBC、HGB计数与对照组相比均无显著差异(P>0.05)；停药后第7天， 5倍推荐剂量组WBC相比于空白对照组显著降低(P<0.05)，该变化在正常范围内。

表2 黄连解毒颗粒对肉鸡血常规指标的影响Tab 2 Effects of Huang-Lian-Jie-Du granules on hematologic indexes in chickens

3.4 给药前、给药第7天及停药第7天血液生化指标 结果(见表3、表4及表5)表明：给药前各组间ALT、AST、TP、ALBⅡ、TC、TG和UREA值无显著差异(P>0.05)；给药第7天、停药第7天各剂量组ALT值相比于对照组显著降低(P<0.05)，其它各项血液生化指标与对照组比较均无显著差异(P>0.05)。

表3 给药前肉鸡血液生化指标Tab 3 Blood biochemical indexes of chickens in each group before administration

表4 给药第7天黄连解毒颗粒对肉鸡血生化指标的影响Tab 4 The influence on blood biochemical indexes in chickens after 7 days administration

表5 停药第7天黄连解毒颗粒对肉鸡血生化指标的影响Tab 5 The influence on blood biochemical indexes in chickens after 7 days withdrawal time

3.5 脏器指数 结果(表6)显示：停药第7天，黄连解毒颗粒各剂量组试验鸡的心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、肺脏指数、肾脏指数、法氏囊指数与对照组相比均没有明显差异(P>0.05)； 1倍推荐剂量组胸腺指数比空白对照组显著增加(P<0.05)。

表6 停药第7天黄连解毒颗粒对肉鸡脏器指数的影响Tab 6 Effects of Huang-Lian-Jie-Du granules on organ coefficient in chickens after 7 days withdrawal time

3.6 病理变化 黄连解毒颗粒5倍推荐剂量组鸡的组织病理学结果显示，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊在内的主要器官均未见明显异常病理变化(图1)。

A1、B1、C1、D1、E1、F1：分别为心、肝、脾、肺、肾、法氏囊的空白对照组组织学切片；A2、B2、C2、D2、E2、F2：分别为心、肝、脾、肺、肾、法氏囊的5倍剂量组组织学切片。A1、B1、C1、D1、E1、F1：Control of heart，liver，spleen，lung，kidney，bursa of Fabricius；A2、B2、C2、D2、E2、F2：5 times dose of heart，liver，spleen，lung，kidney，bursa of Fabricius.图1 组织病理学观察 (HE 100×)Fig 1 Result of histopathological (HE 100×)

4 讨论与结论

研究表明，黄连解毒汤具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血脂、抗肿瘤及免疫调节、调节肠道菌群和保护胃肠黏膜等作用，该方剂中的有效化学成分为黄芩素、黄芩苷、小檗碱(又称黄连素)及栀子苷[7]。黄连解毒汤提取物可显著降低MAPKs磷酸化，并抑制NF-κB转录活性和IκBα的降解，发挥抗炎作用[8]。该方剂对溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等均有较好的抑菌效果[9]，其中黄芩是发挥抑菌作用的主药[10]。

本试验采用黄连解毒颗粒1倍、3倍、5倍推荐剂量进行饮水给药，结果显示，黄连解毒颗粒各剂量给药组鸡临床表现、饮食、粪便均正常，5倍剂量组鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊器官的剖检及组织学检查均未见眼观病变。各剂量组平均日增重均高于空白对照组，料肉比均低于空白对照组，说明黄连解毒颗粒还发挥促进动物生长作用[11]，在一定程度上降低料肉比，提高经济效益。

ALT是肝脏受损的一项重要指标[12]，给药第7天、停药第7天各剂量组ALT值相比于对照组显著降低(P<0.05)，同时肝脏组织切片没有观察到器质性病变，表明使用黄连解毒颗粒具有一定的保护肝细胞及抗损伤作用，这与黄芩苷及黄芩素对APAP诱导的肝毒性保护作用结果相同[13]。TC、TG值与脂代谢相关，给药第7天，黄连解毒颗粒各剂量组TC、TG值均表现降低，这与小檗碱可通过增加肝脏低密度脂蛋白受体的表达来降低高胆固醇血症患者的血浆胆固醇和甘油三酯的结果一致[14]。停药后第7天， 5倍推荐剂量组WBC相比于空白对照组显著降低(P<0.05)，所有血液指标变化均在正常范围内。停药后第7天，1倍推荐剂量组脾脏和胸腺脏器指数比空白对照组有相对增加，证实黄连素发挥了免疫调节作用[15]，且1倍推荐剂量给药提高免疫的效果最好。

综上所述，黄连解毒颗粒5倍推荐剂量连续给药7 d对靶动物鸡是安全的。