氧化石墨烯氧化状态/横向尺寸对肝脏细胞死亡机制和炎症反应的影响

陈 曦， 刘佳尚， 洪 华

（华东理工大学教育部医用生物材料工程研究中心，材料科学与工程学院，上海 200237）

石墨烯是一种二维碳纳米材料，具有比表面积大、电导率高、光学透明性好、机械强度高等优点，在电子和生物医学领域具有重要的应用价值[1-2]。然而，石墨烯也具有高度疏水性，以及在水环境中分散性差等缺点，限制了其在生物医学方面的应用潜力[3]。氧化石墨烯(GO)是在强酸性和氧化条件下，通过化学剥落石墨，在基面和边缘位点产生环氧、羟基和羧基合成而得[4]，更容易在水中分散[5]。GO 保留了石墨烯的大部分特性，可广泛应用于生物医学领域，如药物输送、组织工程、生物传感和生物成像[6-8]等方面。另外，GO 的其他物理化学特性(如表面功能和横向尺寸)对其在生物医学方面的应用也至关重要[9-10]。

虽然已有关于GO 生物相容性的研究报道，但大多数报道集中在GO 对脊椎动物的抗菌作用或对肺组织的毒性上[11]，而没有考虑GO 可能从肺部易位进入其他组织和器官或通过其他途径进入体循环[12-13]。此外，作为药物载体，GO 主要被单核巨噬细胞系统(MPS)吞噬[14]。肝脏中枯氏（Kupffer）细胞是MPS 的重要组成部分，约占体内所有肝脏细胞数的15%或组织中巨噬细胞数的80%～90%[15-16]。枯氏细胞具有保护肝细胞（Hepatocyte）的功能，包括通过吞噬作用清除细胞碎片或颗粒物质[17]。枯氏细胞释放的降解产物通过肝细胞摄取、代谢和排泄，但该过程可导致炎症反应，如分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)和白细胞介素-1β (IL-1β)等炎症因子[18-19]。此外，枯氏细胞还可调节和维持肝细胞的解毒功能，如通过细胞色素P450 酶的代谢转化化学物质[20-21]。由此可见，枯氏细胞与肝细胞之间存在大量的胞间交流。肝窦内皮细胞(Liver Sinusoidal Endothelial Cell,LSEC)作为重要的过滤屏障也参与胞间交流，并调控枯氏细胞与肝细胞之间的抗炎反应环路[22]，这包括分泌干扰素-β (IFN-β)和白细胞介素-10（IL-10）[23-24]。大量研究证明，颗粒物质(包括纳米材料)能破坏枯氏细胞、肝细胞和肝窦内皮细胞之间的稳态关系，同时会对肝脏组织产生不良后果。特别是GO 可以进入血液并影响肝脏功能，包括产生急性和慢性炎症反应[25-27]。然而，GO 与不同肝脏细胞的相互作用机制尚未完全揭示。

虽然曾有科学家试图将GO 的物理化学性质(如横向尺寸和氧化状态)与细胞毒性联系起来，但这些结果彼此矛盾[28-31]。例如，Zhang 等[30]报道，在HeLa 细胞中，尺寸较小的GO 比尺寸较大的GO 能诱导更高的氧化应激反应和细胞毒性。相反，Ma 等[31]发现，在J774A1 细胞中，尺寸较大的GO 比尺寸较小的GO 更容易诱导细胞毒性和炎症反应。除了GO 的大小，鲜有报告详细说明其他理化性质对GO 生物安全性的影响[32-33]。Li 等[34-35]最近证明了GO 表面的氧化和水合状态在催化抗菌反应和诱导哺乳动物细胞毒性方面的重要性，并证明了水合GO 表现出极高的碳自由基密度，它们通过膜结合和诱导脂质过氧化反应，分别对大肠杆菌和哺乳动物细胞产生抑菌作用和毒性作用。然而，类似的表面功能对肝脏细胞(如枯氏细胞、肝窦内皮细胞和肝细胞)的影响鲜见被探索。

本文研究不同氧化状态和横向尺寸的GO 对3 种肝脏细胞枯氏细胞Kup5、肝窦内皮细胞SKHEP-1 和肝细胞Hepa 1-6 生物学功能的影响。首先制备了大小两种不同尺寸(分别约为510 nm 和110 nm)的原始氧化态氧化石墨烯(pGO)和还原态氧化石墨烯(rGO)的薄片（根据尺寸不同分别表示为pGO-L，pGO-S 和rGO-L，rGO-S）。其次，系统研究了不同GO 对细胞毒性、细胞摄取、细胞膜黏附、溶酶体损伤、细胞死亡和炎症反应的影响。实验结果表明GO 在肝脏细胞系中产生了不同的细胞死亡机制和炎症反应，这与GO 的氧化状态和横向尺寸密切相关。实验结果为后续构效关系(Structure-activity relationships)的建立提供了重要的实验数据支持，也为评估GO 材料的安全性提供了理论依据。

1 实验部分

1.1 pGO 和rGO 的合成

通过Hummers 方法制备pGO。简单来说，首先将石墨薄片（AsburyMills3061 级）氧化，过滤并离心以除去残留的污染物；然后将氧化的石墨薄片重新分散在N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，并在冰浴中用55W 超声波分解器超声处理2 h；最后以5000 r/min的转速离心10 min 收集样品，并用去离子水洗涤3 次，得到pGO。

rGO 的合成。将pGO 分散在NMP 中，在55 W超声波分解器中超声处理1 h，然后在150 ℃硅油浴中搅拌5 h，用去离子水洗涤3 次以除去残留的NMP，得到rGO。

1.2 pGO 和rGO 的荧光标记

通过酰胺化反应制备牛血清蛋白-异硫氰酸荧光素（BSA-FITC）荧光标记的pGO 和rGO 样品。将5 mg 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）分别溶解在2 mL 的pGO 和rGO 的悬浮液（pGO 和rGO 的质量浓度均为100 μg/mL）中。然后将上述溶液在室温下搅拌2 h，再将pGO 和rGO 沉淀物用去离子水洗涤2 次，并通过15000 r/min 离心10 min 进行收集。将收集的pGO 与rGO 样品分别与1 mL BSAFITC 溶液（0.1 mg/mL）混合搅拌并反应12 h。随后，将样品在去离子水中洗涤3 次，得到荧光标记的pGO 和rGO 样品。

1.3 pGO 和rGO 的理化特性表征

（1）采用原子力显微镜（AFM，牛津仪器科技（上海）有限公司, Cypher ES 型）确定pGO 和rGO 样品的薄片尺寸。将pGO 或rGO 薄片沉积在经（3-氨基丙基）-三乙氧基硅烷（APTES，2.5 mmol/L）水溶液预处理的硅片上，然后在250 °C 退火30 min。在每个样品的随机位置捕获AFM 图像，并使用Gwyddion成像处理软件对图像进行后处理。通过分析至少25 个单独的薄片以获得所有薄片样品的平均大小。

（2）pGO 和rGO 的元素组成和化学状态测定。采用带有光斑大小为300 μm 的单色AlKα源和电荷补偿溢流枪的X 射线光电子能谱仪（XPS，Thermo Scientific ESCALAB 250Xi）进行评估。

（3）采用拉曼光谱仪（Renishaw plc, 英国Renishaw公司），对pGO 和rGO 样品的化学结构进行表征。

（4）采用Zeta 电位分析仪（美国Brookhaven 仪器公司, NanoBrook ZetaPALS 型）测量pGO 和rGO 样品的动态尺寸和ζ电位。

（5）采用接触角测量仪（FTA125 型，美国 First Ten Angstrams 公司）测量pGO 和rGO 的接触角。

1.4 吞噬溶酶体模拟液（PSF）的配制

分别将4084.6 mg 邻苯二甲酸氢钾、142.0 mg无水磷酸氢二钠、6650.0 mg 氯化钠、71.0 mg 无水硫酸钠、29.0 mg 氯化钙二水合物和450.0 mg 甘氨酸加入到1 L 去离子水中，混合均匀，并用0.1 mol/L 氢氧化钾溶液调节至pH=4.5。

1.5 肝脏细胞培养

将Kup5 在37 °C 和5%（体积分数，下同）CO2环境中培养于Dulbecco's Modified Eagle's 培养基（DMEM）中，该培养基含有10%（体积分数，下同）胎牛血清，10 μg/mL 牛胰岛素，100 units /mL 青霉素，100 g/mL 链霉素和250 μmol/L 1-硫代甘油细胞通过TrypLETMExpress 消化后用于传代培养。将SKHEP-1 在37 °C 和5% CO2的环境中培养于Eagle's Minimum Essential 培养基（EMEM，包含10%胎牛血清，100 units /mL 青霉素和100 g/mL 链霉素）中，并通过2.5 mg/mL 胰蛋白酶（溶于磷酸盐缓冲液中）−0.53 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）消化后用于传代培养。将Hepa 1-6 在37 °C 和5% CO2环境中培养于DMEM 中，并通过2.5 mg/mL 胰蛋白酶（溶于磷酸盐缓冲液中）−0.53 mmol/L EDTA 消化后用于传代培养。

1.6 细胞毒性评估

将Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 各2×104个细胞分别接种到黑底色的96 孔板（细胞死亡实验）中或白底色的96 孔板（细胞活力测定）中过夜。将除Hepa 1-6 外的细胞用0.5 μg/mL 脂多糖（LPS）预处理4 h，然后再将细胞暴露于质量浓度分别为6.25、12.5、25 μg/mL 和50 μg/mL 的pGO 或rGO 材料中24 h。通过CellToxTMGreen 细胞毒性检测试剂盒分析细胞死亡情况，通过ATPliteTM一步法检测系统分析细胞活力[36]。在SpectraMax M5 微孔板分光光度计上读取荧光（细胞死亡测定）和发光强度（细胞活力测定）。

1.7 膜联蛋白V /碘化丙腚染色评估细胞死亡

将Kup5、SK-HEP-1 和Hepa1-6 各1×106个细胞分别接种于孔板中，并用pGO 或rGO（50 μg/mL），在5% CO2环境中于37 °C 孵育16 h。用细胞铲（Fisher Scientific）铲取细胞，然后通过200g离心5 min 收集。然后将细胞悬浮在含有50 μg/mL 膜联蛋白V 和50 μg/mL 碘化丙锭（PI）的结合缓冲液中进行染色。避光、冰浴孵育15 min 后，通过流式细胞仪分析细胞。在FITC 通道中测量膜联蛋白V 荧光，在藻红蛋白（PE）通道中测量PI 荧光。使用前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）获取至少10 000 个细胞的数据。将凋亡细胞鉴定为膜联蛋白V 或膜联蛋白V/PI 阳性细胞，而非凋亡细胞鉴定为膜联蛋白V 阴性/PI 阳性细胞。

1.8 细胞凋亡评估

将Kup5、SK-HEP-1 各2×104个细胞分别接种在96 孔板（白底色）的每个孔中，并放置过夜。在暴露于50 μg/mL 的pGO 或rGO 之前，先用0.5 μg/mL LPS 对细胞进行预处理。孵育16 h 后，通过使用Caspase-GLO3/7 发光测定试剂盒（Promega）检测caspase-3/caspase-7 表达来评估细胞凋亡。

1.9 细胞骨架解离评估

将Kup5 细胞以每孔5×104个的细胞密度接种到8 孔的带盖玻片上。然后在37 °C、5% CO2环境下与50 μg/mL pGO 共孵育。12 h 后，将细胞用4%（质量分数，下同）多聚甲醛（ PFA）固定20 min。将细胞骨架和细胞膜分别用5 μg/mL AF647-phalloidin 和5 μg/mL AF488-偶联小麦胚芽凝集素（WGA）染色30 min，使用共焦显微镜观察细胞骨架。

1.10 材料与细胞结合评估

将Kup5、SK-HEP-1、Hepa 1-6 各4×104个细胞接种到8 孔板中，孵育过夜，然后在37 °C 下与50 μg/mL的pGO 或rGO 共培养16 h。处理后，将细胞用PBS洗涤3 次，然后用4% PFA 固定30 min。细胞膜和细胞核分别用AF488-WGA（5 μg/mL）和Hoechst 33342（10 μg/mL）染色30 min。使用共聚焦显微镜观察pGO 或rGO 与细胞的结合情况。使用细胞铲铲取细胞，在低温PBS 中洗涤3 次。通过流式细胞仪对至少104个细胞进行侧向散射分析来评估材料与细胞的结合百分比。为了抑制B 族I 型清道夫受体（SRB1），使用选择性抑制剂BLT-1（Block Lipid Transport-1，Sigma）对SK-HEP-1 和Hepa1-6 细胞进行8 h 预处理，再通过流式细胞仪的侧向散射对细胞摄取进行定量，并且每种样品至少分析104个细胞。

1.11 材料与细胞膜相互作用评估

将Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 各5×105个细胞接种在12 孔板上，过夜后暴露于50 μg/mL pGO 或rGO 中。6 h 后，将细胞用2%（质量分数）戊二醛固定2 h，再在1%（质量分数）四氧化锇（OsO4）中固定1 h，将细胞在用环氧丙烷处理的分级乙醇梯度（体积分数分别为30%，50%，70%，90%和100%）中脱水，并嵌入树脂中。在超薄切片机上切割成厚度约为50～70 nm 的切片。切片用醋酸铀酰和Reynolds 柠檬酸铅染色，并在透射电子显微镜（TEM）下进行观察。

1.12 细胞膜脂质过氧化评估

将Kup5、SK-HEP-1、Hepa 1-6 各4×104个细胞接种到8 孔板中，孵育过夜，然后再暴露于25 μg/mL pGO 或rGO 中12 h。 将20 μmol/L 过氧化氢异丙苯（CH）处理1.5 h 的细胞用作阳性对照。 处理后，将细胞用PBS 洗涤3 次，然后用10 μmol/L 脂质过氧化探针Image-iT 染色30 min。分别在581 nm/591 nm（Texas Red）和488 nm/510 nm（FITC）的激发/发射波长下检测到成像探针的还原和氧化。通过使用流式细胞仪中的FITC 通道定量细胞脂质过氧化的百分比。

1.13 溶酶体损伤和组织蛋白酶B 释放评估

将Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 各4×104个细胞接种到8 孔板中，并放置过夜。将细胞（Hepa 1-6 除外）用0.5 μg/mL LPS 预处理4 h，然后，将200 μL pGO 或rGO 以50 μg/mL 的剂量添加到细胞中，并孵育6 h。再用4%PFA 固定30 min，将细胞用PBS 洗涤3 次，并以26 nmol/L 的Magic Red（ImmunoChemistry Technologies）染色2 h。以未暴露的细胞用作阴性对照，以50 μg/ mL 尿酸单钠（MSU）处理的细胞用作阳性对照。

1.14 白细胞介素-1β（IL-1β）分泌评估

将Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 各2×104个细胞接种到96 孔板中，并放置过夜。用0.5 μg/mL LPS 预处理细胞（Hepa 1-6 除外）后，分别用质量浓度为 6.25、 12.5、 25 μg/mL 和 50 μg/mL 的 pGO 和rGO 处理细胞。24 h 后收集上清液，评估IL-1β 浓度。

2 实验结果

2.1 GO 纳米片的制备及理化性质表征

参照文献[35]方法制备氧化状态和横向尺寸不同的GO 纳米片。通过原子力显微镜研究GO 纳米片的横向尺寸和形貌，显示pGO-S 和rGO-S 的横向尺寸分别约为115、161 nm，pGO-L 和rGO-L 的横向尺寸分别约为510、501 nm (图1（a） )。利用X 射线光电子能谱测定GO 的表面官能团，在284、286、288、290 eV 处得到特征峰，分别代表C−C、C−O、C＝O 和O＝C−O 基团(图1（b）)。通过分析官能团分布，证明rGO 中氧质量分数比pGO 中显著降低(表1)。利用拉曼光谱对材料的结构进行评估，特征D 峰(峰值约为1331 cm−1)表示sp2碳环的无序，G 峰(峰值约为1596 cm−1)表示C−C 键的拉伸，评估结果符合纳米片石墨烯的特征(图1（c）)。通过确定D 峰峰强(ID)和G 峰峰强(IG)的比值，对结构缺陷进行评估，显示rGO 样品中结构缺陷略有增加，这很可能是还原过程导致的结果[37]。此外，还原过程可改变GO 的疏水性/亲水性，因此，进一步测量了GO 样品的接触角，如图1（d）所示。与原始样品pGO-L 的接触角（60.3°±1.2°）相比，rGO-L 的接触角增加到93.4°±1.5°，表明rGO-L 的表面疏水性增加。

表1 GO 材料的氧碳质量比和氧化基团质量分数Table 1 Quantification of oxygen-to-carbon mass ratio and the mass fractions of oxidized groups of GO materials

图1 GO 材料理化性质的表征Fig. 1 Physicochemical characterizations of GO materials

将GO 分别悬浮在Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 细胞培养液中测定pGO 和rGO 的大小分布 (表2)。在3 种细胞培养液中，pGO-S 和rGO-S 的大小约为260～390 nm，而pGO-L 和rGO-L 的大小约为450～770 nm。聚合物分散性指数（PDI）均小于0.4，说明pGO 和rGO 在这些介质中分布较好。此外，所有样品在细胞培养基中显示负电位。综上所述，证实已经制备出后续实验所需的GO，用于研究其氧化状态和横向尺寸对肝脏各类细胞的影响和作用。

表2 pGO 和rGO 纳米片在细胞培养基中的水合粒径和Zeta 电位Table 2 Hydrodynamic size and Zeta potential of pGO and rGO nanosheets in different cell culture media

2.2 GO 在肝脏细胞中的细胞毒性效应

以氧化锌纳米颗粒(ZnO,D=（22.6 ± 5.1）nm)作为阳性对照，诱导细胞毒性，如图2 所示。可见3 种肝脏细胞孵育24 h 后，pGO 和rGO 的细胞毒性存在显著差异。随着剂量(0 ～ 50 μg/mL)的升高， pGO 和rGO 诱导的Kup5 细胞死亡增加（图2（a）），同时伴随着细胞活力下降(图2（b）)。在Kup5 细胞中，pGO 的毒性高于rGO，而pGO-L 和rGO-L 的毒性高于pGOS 和rGO-S。与Kup5 相比，pGO 对SK-HEP-1 的细胞毒性未被检测到，但rGO 呈现显著毒性。当剂量达到50 μg/mL 时，SK-HEP-1 细胞在rGO-S 和rGO-L中的死亡率分别为72.6%和69.4%。值得注意的是，在所有剂量的实验中，无论GO 横向尺寸的大小如何，Hepa 1-6 细胞对pGO 或rGO 的反应均显示出最小的细胞死亡率。以热区图形式表达的细胞死亡(图2（c）)清楚地显示了pGO 和rGO 在肝脏细胞中不同的细胞毒性。

图2 GO 在 Kup5、 SK-HEP-1 和 Hepa 1-6 细胞中的毒性实验Fig. 2 Cytotoxicity of GO in Kup5, SK-HEP-1 and Hepa 1-6 cells

2.3 GO 诱导三种肝脏细胞死亡的机制

进一步研究GO 诱导细胞死亡的机制。采用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，并使用膜联蛋白V 染色，以ZnO 纳米颗粒作为阳性对照。结果显示，膜联蛋白V 没有显著变化，表明Kup5 属于非凋亡性细胞死亡。观察图3（a）可知，rGO 诱导Kup5 细胞凋亡[38]，rGO-L 和rGO-S 分别导致44.0%和45.0%的细胞凋亡；相比之下，经pGO-S 或pGO-L 处理后的SK-HEP-1 很少有凋亡或非凋亡性细胞死亡，然而，rGO 却诱导SK-HEP-1 细胞凋亡； 在经pGO 或rGO 处理后的Hepa 1-6 细胞中，未观察到明显的凋亡或非凋亡性细胞死亡。为了进一步证实Kup5 和SK-HEP-1 的细胞凋亡情况，检测了caspase -3 和caspase-7 的活化程度（ 图3（ b） ） 。 结果表明caspases-3 和caspase-7 在Kup5 和SK-HEP-1 细胞中被rGO激活。Kup5 细胞中，caspases-3 和caspase-7 的活性在rGO-L 组和rGO-S 组中分别增长了3.9 倍和3.3 倍；而SK-HEP-1 细胞中caspases-3 和caspase-7 的活性在rGO-L 组和rGO-S 组中则分别增长了1.6 倍和1.8 倍。与控制组相比，pGO 处理的Kup5和SK-HEP-1 细胞中均未检测到明显的caspase-3 和caspase-7。综上所述，pGO 在Kup5 细胞中触发非凋亡性细胞死亡，但对SK-HEP-1 细胞几乎无影响；而rGO 在Kup5 和SK-HEP-1 细胞中均主要触发凋亡性细胞死亡；所有GO 对Hepa 1-6 细胞均未检测到明显的细胞毒性。图3（c）所示的差异干涉对比(DIC)显微镜检测结果进一步表明，pGO 诱发Kup5细胞肿胀，但不诱发SK-HEP-1 或Hepa 1-6 细胞肿胀。特别是pGO 引起Kup5 细胞肿胀后细胞膜破裂，导致细胞内部物质大量释放，这些图像使人联想到细胞程序性坏死（necroptosis）的特征，即细胞骨架结构遭受破坏并发生细胞质和细胞膜脱离。为了研究pGO 处理后细胞骨架从细胞膜上的脱离情况，用Alexa Fluor 633（AF663）偶联鬼笔环肽（phalloidin）染色Kup5 细胞骨架(F-actin)，用WGA 488 染色细胞膜，发现 pGO 剂量为50 μg/mL 时，大量细胞骨架从细胞膜上脱落(图3（d）)。

图3 GO 诱导3 种肝脏细胞死亡的机制Fig. 3 Mechanisms of cell death for three types of liver cells induced by GO

2.4 GO 与肝脏细胞结合并引发脂质过氧化反应

细胞死亡机制差异可能是由于pGO 和rGO 与细胞膜、细胞器等相互作用的差异而产生的。将荧光标记的纳米片在Kup5 细胞中暴露16 h。细胞膜用Alexa Fluor 594 (WGA 594)共染色，细胞核用Hoechst 33342 染色。GO 与肝脏细胞结合实验如图4 所示。由图4（a）可知，与原始材料相比，虽然pGO （pGOL 和pGO-S）可以与Kup5 细胞相互作用，但表面膜的广泛损伤和脱落（白色箭头所示）干扰了颗粒的观察或细胞的摄取。rGO（ rGO-L 和rGO-S）在Kup5 细胞中表现出广泛的细胞摄取能力，细胞膜损伤可忽略不计。流式细胞仪的侧向散射粒度分析结果证实了pGO 和rGO 细胞关联的总体差异。这一结果与TEM 图像一致，rGO 纳米片被带入Kup5 细胞，而pGO 黏附在Kup5 膜上，可导致膜过氧化，从而导致膜损伤(图4（d）)。与Kup5 细胞相比，未发现pGO和rGO 造成SK-HEP-1 细胞膜损伤(图4（b）)。流式细胞仪分析结果证实pGO 和rGO 与SK-HEP-1细胞结合比例相接近(25.6%～34.6%)，而pGO 和rGO 与Hepa 1-6 细胞结合较少(<12%，图4（c）)，值得注意的是pGO 和rGO 与SK-HEP-1 细胞的结合比例高于其与Hepa 1-6 细胞的结合比例；前期研究发现肝窦内皮细胞表达了大量的SR-B1，该受体介导脂质转移和细胞摄取，而肝细胞中SR-B1 的表达相对较低[39]，因此推测SK-HEP-1 和Hepa 1-6 细胞结合程度差异可能是由SR-B1 介导所致。为证明该观点，在用pGO 和rGO 处理SK-HEP-1 细胞和Hepa 1-6 细胞之前，使用选择性抑制剂BLT-1 来阻断SR-B1 信号。为便于对比，分别用蓝色和红色表示SR-B1 信号被阻断前后的细胞结合情况，如图4（e）所示。结果表明，SR-B1 信号被阻断后，GO 与SK-HEP-1 细胞的结合比例显著降低至5%以下，相比较而言，GO 与Hepa 1-6 细胞结合情况未见明显差异。这表明SR-B1在pGO 或rGO 对SK-HEP-1 的细胞摄取中起着重要作用，也解释了GO 对SK-HEP-1 和Hepa 1-6 在细胞结合和细胞摄取方面存在差异的原因。

图4 GO 与肝脏细胞的细胞结合实验Fig. 4 Cellular association of GO with liver cells

Li 等[35]已证明pGO 可以诱导细胞膜上的脂质过氧化。因此，以氢过氧化异丙苯(CH)作为阳性对照，使用C11-BODIPY 试剂（Image-iT kit）检测三种肝脏细胞被pGO 和rGO 处理后细胞膜脂质过氧化情况（图5）。在过氧化过程中，C11-BODIPY 试剂(激发和发射波长分别为581 nm 和591 nm)的荧光发射峰从约590 nm(红色)处转移到约510 nm(绿色)处，表明pGO 在Kup5 细胞中诱导了细胞膜脂质过氧化，而在SK-HEP-1 和Hepa 1-6 细胞中，pGO 未造成明显的细胞膜脂质过氧化。流式细胞仪结果显示pGO-S 和pGO-L 分别诱导8.1%和16.9%的Kup5 细胞发生脂质过氧化(图5（a）)。相比之下，SK-HEP-1和Hepa 1-6 细胞未见明显脂质过氧化现象(图5（b）～5（c）)。而rGO 对Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 细胞的脂质过氧化作用均较小。综上所述，pGO 诱导Kup5 细胞膜脂质过氧化可能是导致Kup5 表面膜损伤和细胞死亡的原因。

图5 GO 诱导肝脏细胞脂质过氧化实验Fig. 5 Lipid peroxidation test of liver cells induced by GO

2.5 GO 引发肝脏细胞溶酶体损伤和炎症反应

除了与细胞膜间的相互作用，GO 也会被细胞内吞。Wang 等[38]已经证明了氧化石墨烯基材料可以诱导巨噬细胞内的溶酶体损伤，导致组织蛋白酶B（Cathepsin B）外释，进而激活NLRP3 炎症小体及促使IL-1β 的释放[40]。使用组织蛋白酶B 底物Magic Red （26 nmol/L）检测Kup5 细胞中溶酶体损伤及组织蛋白酶B 外释情况(图6)。用尿酸单钠(MSU)晶体作为阳性对照，从点状染色模式变为溶酶体损伤后的弥漫性染色模式。结果表明，pGO 未造成Kup5细胞溶酶体损伤，这与2.4 节实验结果相符合。在Kup5 细胞中，pGO 主要与细胞膜相互作用，未被Kup5 细胞内吞(图4（d）)，而rGO 导致显著的溶酶体损伤。pGO 和rGO 均被肝窦内皮细胞内吞，但只有rGO 引起溶酶体损伤。在pH 为4.5 的溶酶体模拟液(PSF)中观察pGO 和rGO 的行为[41]，结果显示，rGO 在PSF 模拟液中尺寸显著增加，达到几微米以上，而pGO 的尺寸增加较少（约1 μm），表明pGO相对于rGO 在PSF 模拟液中较为稳定(表3)。这一结果与图3（c）中rGO 在细胞内大量聚集现象相一致。溶酶体的平均大小为0.1 ～ 1.2 μm，因此认为rGO 在溶酶体中的不稳定性导致了溶酶体损伤[42]。

表3 pGO 和rGO 在溶酶体模拟液（pH 4.5）中6 h 后的水合粒径Table 3 Hydrodynamic sizes of pGO and rGO after suspending in lysosomal simulant fluid (pH 4.5) for 6 h, respectively

进一步评估了三种肝脏细胞暴露于不同质量浓度pGO 和rGO 中24 h 后IL-1β 的释放情况，如图7所示。可以看出rGO 诱导Kup5 和SK-HEP-1 细胞中IL-1β 的释放，而pGO 对两者的影响可忽略。其中，rGO-L 和rGO-S 因尺寸不同造成Kup5 细胞中IL-1β 的释放量不同，相比而言这种现象在SK-HEP-1 中并不明显。这与细胞毒性结果一致。同时检测了Hepa-1-6 细胞中IL-1β 的释放情况，表明pGO 和rGO 对IL-1β 释放造成的影响差别很小(图7（c）)。

图7 Kup5，SK-HEP-1 和 Hepa 1-6 三种肝脏细胞暴露于pGO 和rGO 24 h 后 IL-1β 的释放Fig. 7 IL-1β production induced by pGO and rGO in Kup5, SKHEP-1, and Hepa 1-6 after 24 h incubation, respectively

3 讨 论

研究了不同氧化状态和横向尺寸的GO 材料在三种肝脏细胞(枯氏细胞、肝窦内皮细胞和肝细胞)中的细胞毒性和炎症反应。结果表明在三种类型肝脏细胞中，GO 在细胞毒性和促炎症作用方面存在显著差异。这些毒理学效应差异是GO 与细胞膜、细胞内吞、细胞溶酶体等作用机制不同所导致的结果。重要的是，细胞毒性效应和炎症反应取决于GO 的表面氧化状态和横向尺寸。GO 诱导肝脏细胞死亡和促炎症反应机理如图8 所示。本文的主要发现为：

图8 GO 诱导Kup5，SK-HEP-1 和 Hepa 1-6 三种肝脏细胞死亡和促炎症反应机理示意图Fig. 8 Schematic illustration of GO induced differential cell death mechanisms and pro-inflammatory responses in Kup5, SK-HEP-1, and Hepa 1-6 cells

（1）在三种肝脏细胞类型中，GO 在细胞毒性方面表现出明显差异，这取决于细胞表面氧化状态和横向尺寸。pGO 仅对Kup5 有诱导坏死作用（pGO-L>pGO-S），对SK-HEP-1 和Hepa 1-6 无毒性作用。rGO 对三种肝脏细胞显示出不同的细胞毒性和细胞死亡机制。rGO 对Kup5 和SK-HEP-1 均有诱导凋亡作用，但对Hepa 1-6 的毒性较小。pGO 和rGO 造成的细胞死亡机制差异与细胞相互作用相关。透射电镜显示，pGO-L 通过其平坦的一侧附着在Kup5 细胞膜上，而没有被细胞吞噬（图4（d））。这可能是因为首先pGO 表面上存在含氧亲水基团(如羟基、羧基、环氧基)，使pGO 具有两亲性，且pGO-L 的接触角为60.3°±1.2° (图1（e）)。其次在含血清的细胞培养基中，pGO 相对分散，其尺寸小于0.5 μm，因而其相对较小的尺寸及带负电荷的表面基团削弱了其与带负电荷的细胞膜之间的相互作用，所以未被细胞吞噬[43-44]。此外，pGO 表面具有活性高的碳自由基，可以与细胞膜发生反应，引起脂质过氧化，进而导致细胞膜损伤和细胞死亡[35]。在Kup5 细胞中，pGO-L 和rGOL 比pGO-S 和rGO-S 的毒性更大。rGO 未造成Kup5 细胞膜脂质过氧化(图5)，但是rGO 被Kup5 细胞和SK-HEP-1 细胞内吞，主要是因为rGO 尺寸较大，更容易触发吞噬作用[44]。同时，rGO 的细胞膜富含烷基脂类和胆固醇，使细胞表面具有疏水特性，有助于疏水材料的内吞[45-46]。rGO 在溶酶体环境中不稳定，形成团聚体(>10 μm)，从而引起溶酶体损伤（图6），通过Fenton 反应释放Fe2+，生成活性氧，释放组织蛋白酶B、D、L，导致线粒体功能障碍和细胞凋亡[47]。此外，组织蛋白酶B 的释放触发NLRP3 炎症小体的激活，导致IL-1β 的释放，并引起细胞凋亡。同样，在肝窦内皮细胞中，rGO 也被SK-HEP-1 细胞内吞，导致细胞凋亡和IL-1β 的产生，其机制可能与Kup5 相似，但不同横向尺寸之间没有差异。对Hepa 1-6 细胞而言，由于rGO 和pGO 与细胞膜相互作用和细胞摄取程度较低，所以pGO 和rGO 均未引起毒性。

图6 Kup5 细胞在pGO 和rGO（50 μg/mL）中处理6 h 后溶酶体损伤及组织蛋白酶B 释放Fig. 6 Lysosomal damage and cathepsin B release in Kup5 cells after treated by pGO and rGO (50 μg/mL) for 6 h,respectively

（2）Kup5，SK-HEP-1 和Hepa 1-6 三种肝脏细胞暴露于GO 后，在IL-1β 的产生方面显示出显著炎症反应差异。对于Kup5 细胞，rGO 通过细胞吞噬进入细胞，并迁移至溶酶体，进而诱导溶酶体损伤。溶酶体损伤诱发组织蛋白酶B 释放和NLRP3 炎症小体激活，从而触发IL-1β 分泌[48]。此外，与较小尺寸的rGO 相比，较大尺寸的rGO 诱导更高的IL-1β 分泌量，因为它们形成较大团聚体，导致更大范围溶酶体损伤(图7)。相比之下，pGO 主要与Kup5 细胞膜相互作用未被内吞，从而未有溶酶体损伤，也几乎未引起IL-1β 分泌。对于SK-HEP-1 细胞，pGO 和rGO 被细胞内吞程度接近。但只有rGO 触发NLRP3炎症小体激活和IL-1β 分泌。这可能由于rGO 在溶酶体内大量聚集而导致溶酶体损伤。在Hepa 1-6 细胞中，pGO 和rGO 几乎未诱导细胞产生IL-1β，这是因为pGO 和rGO 与Hepa 1-6 细胞膜相互作用较少，且被细胞内吞程度较小。

GO 广泛应用于生物医学领域，包括药物输送、组织工程、生物传感和生物成像。肝脏是GO 的一个主要靶点，不同类型的肝脏细胞对GO 的细胞毒性和炎症作用呈现差异化，主要是因为GO 表面氧化状态和横向尺寸不同所致。这些实验数据有助于设计更安全的生物医用GO。例如，与大尺寸的pGO 相比，小尺寸的pGO 对枯氏细胞、肝窦内皮细胞和肝细胞的细胞毒性和炎症作用更低。进一步对GO 进行表面修饰，如聚乙二醇化或涂覆多聚物，可能需要减少GO 与枯氏细胞膜的相互作用，从而减少脂质过氧化、细胞膜损伤和细胞死亡。此外，应该避免使用rGO，因为rGO 在细胞中形成聚集，容易被枯氏细胞和肝窦内皮细胞内吞，从而诱导炎症反应和细胞凋亡。

本文对于理解GO 对肝脏的潜在毒性作用具有相当重要的意义，但目前的研究是在体外条件下采用静态二维细胞培养系统，无法反映肝脏的动态血流和三维结构，存在一定的局限性，因此，有必要进行体内实验来验证体外实验结果，从而有助于开发应用于生物医学的更安全的GO 材料。

4 结束语

本文证明了GO 的氧化状态和横向尺寸在三种主要肝脏细胞类型的细胞死亡机制和炎症反应中的关键作用。pGO 通过枯氏细胞的细胞膜损伤诱导细胞死亡 (pGO-L>pGO-S)，在肝窦内皮细胞和肝细胞中未检测到细胞毒性和炎症反应。相比之下，rGO在枯氏细胞和肝窦内皮细胞摄取后通过溶酶体损伤诱导细胞凋亡 (rGO-L>rGO-S)。此外，rGO 在枯氏细胞和肝窦内皮细胞中触发IL-1β 分泌，但对肝细胞的影响较小。本文为探索GO 对肝脏毒性作用提供了实验数据，并为GO 在生物医学方面的应用提供了理论支持。