火山石对高金属耐受性铁氧化菌的固定化表征

杨健，王伟东，王彦杰，晏磊

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

铁氧化菌大多是革兰氏阴性细菌，是一类以CO2作为碳源、嗜酸并且化能自养、推动铁循环的微生物[1-2]，能够通过将Fe2+氧化成Fe3+获得能量，其产能方程式为：2Fe2++1/2O2+2H+→2 Fe3++H2O+88.7KJ[3]。铁氧化菌广泛分布于矿区废水、工业废水、湖泊、温泉、热泉、火山堰塞湖等水环境中，在生物圈中无处不在。经过研究学者分离纯化，种类繁多铁氧化菌被分离出来并获得纯培养菌株，其中较为常见的有锈铁菌属、纤毛铁细菌属、嗜酸性氧化亚铁杆菌属等[4]。铁氧化菌作为重要的生物浸矿菌种，被广泛应用于铜，镍，金，铀等金属的工业化生物浸出过程中[5-7]。在生物浸出过程中，铁氧化菌的生物浸出能力通常会因环境条件的变化而受到影响。比如温度的升高，pH的变化，营养物质的减少及重金属离子的出现和浓度升高等，这些浸出条件的变化不利于铁氧化菌正常发挥其浸出功能，因此会极大降低铁氧化菌的浸出活性和金属回收率[8]。尽管研究表明，铁氧化菌经过长期的生物浸出金属矿石应用后，铁氧化菌对很多重金属离子耐受能力逐渐提升，更加适合生物浸出金属矿石中的金属，具有极高的金属浸出率[9-10]。但将铁氧化菌用于生物浸出回收电路板中的金属时，其应用难度将增加。电路板与金属矿石组成大不相同，电路板中主要有铜、镍、铬、镉、铅、金、银等金属，并且它们在电路板中的含量普遍高于在矿石中的含量[11]，与生物浸出回收金属矿石中的金属相比，生物浸出回收电路板中的金属更加依赖铁氧化菌对多种重金属的金属耐受性。铜离子和镍离子是电路板中含量较多的金属，也是生物浸出电路板时最容易回收、最常出现的金属[12]。当铜和镍离子含量相对于其他金属离子含量较低时，对于铁氧化菌的生物浸出能力的影响是极小的，对铁氧化菌的生长是低害或无害的，铁氧化菌仍然会保持较高的亚铁氧化活性和生物浸出能力，但是随着生物浸出进程的推进，浸出液中内铜镍离子的含量不断增加，就会逐渐表现出对铁氧化菌细胞的毒害作用，铁氧化菌的亚铁氧化活性逐渐被抑制，生物浸出能力降低，铁氧化菌的生物学活性受到影响，最终导致金属回收率的降低[13]。

为此，很多研究借用固定化的方式避免金属对铁氧化菌的毒害。研究表明利用铁氧化菌固定化细胞浸出电路板中金属是可行的，并且绿色环保，节约经济成本。作为一种常见的生物工程方法，固定化技术在废水无害化处理、难降解物质无害化处理、土壤改良等领域的应用研究已取得了丰硕的成果[14]。固定化细胞有很多好处：首先固定化细胞容易制备，并且与菌种的活化和培养相比更加方便和实用；其次固定化细胞更加易于保存和使用，可以将固定化细胞保存在冰箱中，使用时固定化的菌种可以很快地在液体培养中恢复自由，能够快速在培养液中生长繁殖。但目前固定化载体大多使用寿命有限，无法循环使用，而且价格较为昂贵。因此，一些廉价的固定化载体如纱布[15]、聚氨酯泡沫[16]、海藻酸钠[17]小球逐渐被开发应用于固定化的过程中。但因固定化载体的限制仍存在对固定量少、固定时效短、固定效果差等问题。

基于上述问题，研究选用疏松多孔的火山石作为固定化材料，火山石相比其他固定化材料更廉价，组成结构更加稳定，更容易获得，依托黑龙江省五大连池火山群落天然地理优势，使得火山石发挥其独特价值，具有极高的应用价值[18]。在此基础上选取高金属耐受性铁氧化菌YFS2—25，在前期试验中证实该菌株在10～30 mmol·L-1铜、镍、铬、镉离子培养液中，均保持60%以上的Fe2+氧化率，因此选用该菌株作为火山石固定化菌株。同时在前期单因素研究基础上，确定了影响火山石固定化铁氧化菌效果显著因素是火山石粒径、固定化时间和摇床转速。因此通过响应面试验设计，以火山石粒径、固定化时间和摇床转速为响应变量，以Fe2+氧化率为响应值，最终确定火山石固定化铁氧化菌的最佳条件。在此基础上，采用SEM表征火山石对铁氧化菌的固定化能力。从而得到一种火山石固定高金属耐受铁氧化菌的固定化颗粒，为生物浸出及固定化领域开发廉价可行的固定化材料和设计方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

试验中所用高金属耐受性铁氧化菌YFS2—25菌株由黑龙江省寒区环境微生物与农业废弃物资源化重点实验室铁氧化菌菌种资源库提供。

1.1.2 试剂

硫酸铵；三水磷酸氢二钾；七水硫酸镁；氯化钾；硝酸钙；七水硫酸亚铁；98%硫酸；98%磷酸；二苯胺磺酸钠；重铬酸钾。

1.1.3 仪器

恒温振荡器（HZQ-C，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、磁力搅拌器（JB-5，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）、pH计（PHB-4，上海仪电科学仪器股份有限公司）、高压蒸汽灭菌锅（MLS-3781LPC，松下健康医疗器械株式会社），扫描电子显微镜（S4800，株式会社日立制作所）。

1.2 方法

1.2.1 培养基方案

研究所使用的培养基配方为改良的9K培养基[19]，其组成为：（NH4）2SO43 g·L-1，KCl 0.1 g·L-1，K2HPO40.5 g·L-1，MgSO4x 7H2O 0.5 g·L-1，Ca（NO3）20.01 g·L-1，室温条件下使用5 MH2SO4调节pH至2.0，高压蒸汽灭菌后，使用0.22 μm滤膜过滤加入40 g·L-1的Fe－SO4x 7H2O。

1.2.2 火山石对高金属耐受性铁氧化菌固定化条件的优化

在前期研究中，以Fe2+氧化率为目标，通过单因素实验探究了温度（20、25、30、35、40℃）、火山石粒径（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 cm）、固定化时间（12、24、36、48、60 h）、摇床转速（40、60、80、100、120 rpm）对于固定化效果的影响。结果表明，火山石粒径、固定化时间、摇床转速对于固定化效果影响最为显著。因此在前期单因素实验的基础上，采用响应面Design-Expert 12.0软件中的Box-Behnken设计响应曲面模型，考察固定化条件对Fe2+氧化率的影响，其中响应变量设定为火山石粒径（X1）、固定化时间（X2）、摇床转速（X3），以Fe2+氧化率（Y）为响应值，从而获得最佳固定化条件。表1是响应面试验因素水平表。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

固定化所采用的火山石采集自五大连池火山群落。固定化试验前，将需要使用的火山石用25%硫酸浸泡12 h，然后使用清水冲洗火山石至无杂质，挑选50 g形态较完整的火山石灭菌后备用。

配制90 mL改良的9K培养基放入250 mL锥形瓶内，将火山石放入改良的9K培养基中，按照10%（v/v）接种培养至对数期的铁氧化菌菌液，置于恒温振荡器培养，每组试验以不接菌的做空白对照，固定化试验完成后。将铁氧化菌火山石固定化颗粒更换新的培养液培养100 h后，测定培养液中亚铁氧化情况。每组实验结果跟空白作比较。Fe2+浓度的测定采用重铬酸钾滴定法[20]。

1.2.3 氧化亚铁硫杆菌的固定化表征

火山石固定化效果采用SEM进行表征，SEM（S-4800，HITACHI，日本）的工作电压为2.0 kV，放大倍数为8.99 mm×10.0 K，采用压片法对火山石的固定化能力进行表征。方法如下：取样品置于粘有导电胶的样品台上，按压紧实，自然风干；左低右高进入机器；设备进行抽真空操作，待抽真空完成后，开启电镜观察；在不同的倍数下寻找需要观察的目标，调节视野；找到目标后，聚焦，拍照，对需要能谱分析的目标进行分析；完成后，将图谱输出。

1.2.4 数据处理

使用IBM SPSS（Version 20，IBM SPSS，Statistics 20.0）进行数据处理，利用Origin Pro（Version 2019b.Originlab Corporation，Northampton，MA.USA）进行绘图，通过Design Expert 12.0（Version 12.0.3.0，1300 Godward Street Northeast，Suit 6400 Minneapolis，MN 55413）进行响应面实验设计。

2 结果与分析

2.1 火山石对高金属耐受性铁氧化菌固定化条件的优化

2.1.1 响应面实验

采用Box-Benhnker模型对固定化条件进行优化，实验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and response values

续表2 Box-Behnken实验设计及结果Continued table 2 Box-Behnken experimental design and response values

2.1.2 模型方程的建立及方差分析

通过Design Expert 12.0软件对表2数据进行分析，得回归方程：Y=Ln[（ferrous oxidation rate-1.00）/（100.00-ferrous oxidation rate）]。其方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

回归方差分析显著性表明，此回归模型显著（P<0.05），C、AC、A2、C2对Y值影响也很显著（P<0.05）。各因素对Fe2+氧化率的影响顺序依次是B>A>C，即固定化时间对Fe2+氧化率的影响最大，其次是火山石粒径，最后是摇床转速。交互项AB相对其他交互项相对显著，表明火山石粒径与固定化时间存在显著交互作用，各影响因素对Fe2+氧化率的影响为非线性关系。根据图1可看出，模型的预测值与实际值十分接近，线性拟合相关系数R2达到95.91，R2ADJ为90.66。结果表明，该模型与实际实验拟合较好。

图1 Fe2+氧化率理论值与实际值分布图Fig.1 Distribution diagram of theoretical value and actual value of ferrous oxidation rate

2.1.3 Fe2+氧化率的单因子响应分析

如图2所示火山石粒径A，固定化时间B、摇床转速C，3个因子对Fe2+氧化率影响曲线的合成图，将其它2个因子固定在中等水平时，每个独立因子对响应变化的影响。以Fe2+氧化率为纵坐标，三因子的取值范围为横坐标，并采用编码替代三因素的实际值：-1～0～1代表火山石粒径0.5～1.0～1.5 cm或固定化时间30～42～54 h，或者摇床转速40～80～120 rpm，三个自变量因子的中间值即1.0，42和80。为研究其中任单一因变化时的固定取值，如研究火山石粒径对Fe2+氧化率的影响时，固定化时间和摇床转速分别固定为42 h和80 rpm。图2中各单因子的扰动对响应值变化趋势可看出，A和B两个因子在区间[-1，1]内Y值的变化是先增大后减小，A因子在1.000水平附近达到最大值；B因子在1.000水平附近达到最大值；C因子在[-1，1]内Y值变化逐渐升高，在1.000水平附近达到最大值。

图2 火山石粒径（A）、固定化时间（B）、摇床转速（C）的单因子曲线图Fig.2 Single factor curves of particle size（a），immobilization time（b）and ratation speed（c）of volcanic rocks

2.1.4 响应面分析

利用Design Expert 12.0软件绘出两两自变量为坐标的等高线图，从图3中可以看出，火山石粒径与摇床转速的响应曲面近似椭圆形，证明火山石粒径与摇床转速对Fe2+氧化率的交互作用相对于其他因素相对较强，而火山石粒径与固定化时间以及摇床转速和固定化时间的等高线图则显示其交互作用并不明显。通过响应面实验，确定火山石固定化铁氧化菌YFS2—25的最佳条件为：火山石粒径1.5 cm，固定化时间42 h，摇床转速为120 rpm。通过验证实验，所得结果与模型结果非常接近，证实所得模型是可行的。

图3 火山石粒径、固定化时间、摇床转速对Fe2+氧化率影响的等高线图（a～c）Fig.3 Contour map（a～c）of effects of particle size，immobilization time and rotation speed of shaking size on ferrous oxidation rate

2.1.5验证试验

为进一步验证该模型的准确性和有效性，根据最优条件进行3次重复实验，结果得到的Fe2+氧化率分别为97.02、96.62和96.52，平均Fe2+氧化率为96.72±0.14，与预测的Fe2+氧化率96.58无显著差异，表明该模型较准确。

2.2 SEM表征高金属耐受性铁氧化菌的火山石固定化

基于响应面试验的最优固定化条件，以铁氧化菌YFS2-25为固定化菌株，火山石为固定化载体进行高金属耐受性铁氧化菌的火山石固定化试验。试验结果如图4所示，由图4a、e可以观察到未固定的火山石表面有孔隙，固定之后，细菌附着在火山石表面，细菌产生的代谢产物等在火山石表面形成生物膜，火山石表面变得光滑；从图4b、f中可以看出大量的铁氧化菌附着在火山石的表面，并且数量极多；随着显微镜放大倍数的增加，从图4c、g可见越来越多的铁氧化菌吸附在火山石表面，火山石的孔洞、裂隙中也存在着大量的铁氧化菌；从图4e、h中可以观察到固定化铁氧化菌后，火山石表面由原来的覆盖有密集的球状突起变为覆盖着一层致密的铁氧化菌，铁氧化菌包裹着这些密集的球状凸起，并且连接成片，形成一个内陷的小孔。由此可见，火山石作为高耐受性铁氧化菌的固定化载体是可行的。

图4 扫描电镜下的火山石表面（a，b，c，d：固定化前；e，f，g，h：固定化后）Fig.4 Surface of volcanic rocks under SEM（a，b，c，d：before immobilization；e，f，g，h：after immobilization）

3 讨论

目前由于铁氧化菌能够将亚铁离子氧化成三价铁离子的特性，将铁氧化菌广泛应用于生物浸出中，结合多种固定化载体，使其更加适用于生物浸出当中，使铁氧化菌在尾矿治理、生物冶金等领域有巨大的应用价值[21]。但是，固定化载体的材料大多存在造价昂贵，携带菌体量少，材料毒性大，不适于铁氧化菌生长等问题。导致载体成为了铁氧化菌固定化细胞应用于生物浸出的关键因素。研究主要以实验室现有的高金属耐受性铁氧化菌YFS2-25为固定化菌株出发，采用响应面分析法对火山石固定化高金属耐受性铁氧化菌的条件进行优化，选择Box-Behnken设计以火山石粒径、固定化时间和摇床转速为响应因素，以Fe2+氧化率为响应值，得到最佳发酵培养条件，火山石粒径1.5 cm、固定化时间42 h和摇床转速为120 rpm。同时通过验证实验，证明在该条件下，可以得到最高的Fe2+氧化率。

以SEM表征火山石固定化铁氧化菌的能力，正如结果所示，火山石在与铁氧化菌共培养后，在SEM下观察到火山石表明有明显的菌落痕迹。在SEM下，火山石表面出现铁氧化菌的堆积，又因为火山石的疏松多孔结构，因此火山石相比其他固定式载体，可固定携带更多对的微生物细胞。细胞固定化后，利用培养液对固定化细胞进行培养，虽然生长比较缓慢，但在试验周期内，一直处于不断的生长阶段，表明固定化细胞具有较长的生长周期，这对于构建生物反应器，从中获取有价值的活性物质是十分有利的。

迄今为止，大多数固定化细胞技术应用还处于实验室研究水平，工业化的投入发展离不开高效固定化生物反应器的研制，同时部分常用的固定化细胞载体对细胞酶活存在着一定的毒性，聚丙烯酰胺、明胶等常用固定化材料也依然存在价格较高的问题。因此，开发新型高效、无毒、廉价的固定化材料仍是目前固定化细胞技术发展的主要方向。相信在材料学及生物学高速发展的当今，固定化技术能够得到不断创新，并应用于更多大规模的工业生产和环境保护领域。

4 结论

以高金属耐受性铁氧化菌为固定化菌株，以Fe2+氧化率为衡量指标，通过利用火山石做为固定化载体对铁氧化菌进行固定化，用响应面软件对其进行发酵条件进行优化，得出最优固定化条件：在最佳固定化条件山石粒径1.5 cm、固定化时间42 h和摇床转速为120 rpm下，可以得到最高的Fe2+氧化率。在此基础上，以火山石作为固定化载体固定化高金属耐受性的铁氧化菌取得了极好的固定化效果，火山石作为固定化载体将成为生物浸出的极大助力，不仅可以降低成本，同时组成稳定，携带铁氧化菌数量多，相比常见的固定化载体，火山石做为固定化载体的实用性更强，固定化能力更好。