不同类型宫颈癌人乳头瘤病毒高危亚型与相关蛋白表达分析

陈 晨 王浩渊

1.广东省江门市中心医院肿瘤科，广东江门 529030；2.广东省江门市中心医院重症医学科，广东江门 529030

宫颈癌是严重威胁女性身体健康与生命安全的妇科恶性肿瘤之一，近年来发病率呈现年轻化和上升趋势[1]。宫颈癌病理分类主要包括鳞癌和腺癌，其中以鳞癌最为常见，约占90%，腺癌约占5%[2]，但由于腺癌临床预后明显低于鳞癌，故进一步明确宫颈鳞癌及腺癌的发生、发展机制对明确宫颈癌发病机理、指导临床干预均有重要的意义和作用。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染其病毒 DNA 能够同宫颈上皮细胞DNA整合，激发自身的免疫系统，对病毒进行清除，但同时也引发局部的上皮损伤，引起宿主细胞的增殖异常，引起鳞状上皮内病变，增加宫颈癌的发生概率[3-4]。HPV不同亚型其致病能力有差异，其中高危型HPV在宫颈癌的形成及发展发挥重要作用[5]。但由于目前宫颈癌发生机制尚未完全明确，且不同类型宫颈癌与HPV高危亚型的关系仍处于研究探索阶段，进一步观察不同类型宫颈癌中HPV高危亚型的分布特征及其相关蛋白表达的差异，对进一步明确不同类型宫颈癌发生机制及指导基础实验的开展具有重要的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2020年2月于江门市中心医院确诊的宫颈癌合并高危型HPV感染患者120例为研究对象。其中年龄26～68岁，平均（50.35±4.46）岁；病理类型：腺癌34例，鳞癌86例；国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期88例，Ⅲ～Ⅳ期32例；组织学分级：Ⅰ级14例，Ⅱ级29例，Ⅲ级77例；病程1～4年，平均（1.89±0.58）年。

纳入标准：①初诊为宫颈癌且择期手术；②均行术中病理检查确诊；③均行HPV检测且HPV亚型均为高危型；④无其他妇科传染性疾病；⑤无其他脏器原发性肿瘤；⑥所有患者及其家属均知情同意。排除标准：①临床资料不全者；②入组前行相关治疗者。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 宫颈分泌物HPV病毒检测 术中以窥器暴露子宫颈，擦净子宫颈口分泌物，使用专用刷插入子宫颈口旋转3周，收集宫颈口及颈管脱落上皮细胞，收集完毕后即刻送检。第二代杂交捕获技术（hybrid capture，HC2）分析HPV亚型，所有操作均由同一检验师完成，结果判定，HPV相对光单位（relative light unit，RLU）>0.8～1.0即判定为阳性，通过HC2高危型HPV检测技术筛查HPV高危亚型，包括HPV l6、18、31、33、35、45、51、52、56、58 型和 HPV 61 型等[6]。

1.2.2 癌组织病理类型检测 所有患者于术中收集宫颈癌组织和癌旁组织，肿瘤组织离体后半小时内于肿瘤组织纵切面的非坏死区域采集标本，癌旁组织于肿瘤组织边缘5 cm处采集，离体后均经焦碳酸二乙酯水清洗，送快速病理与免疫组化检测。

1.2.3 蛋白免疫组化检测 采用SP法对宫颈癌组织和癌旁组织进行免疫组化染色，相关试剂均购自Abcam公司，相关操作均由同一组医师进行，具体步骤参照试剂盒说明。选取宫颈鳞癌与腺癌中占比最高的HPV高危亚型进行蛋白染色结果分析，目标蛋白包括 E6、E7、P53 和 Rb 蛋白，E6、E7 蛋白阳性判定以试剂盒内相应的蛋白阳性模板为准，P53和Rb蛋白采用二级计分法，染色强度得分为0、1、2、3。阳性细胞百分比≤10%、11%～50%、51%～75%、≥76%分别对应得分 1、2、3、4，半定量标准=细胞的染色强度×阳性细胞的百分比，阴性值为0～3，阳性值为>3[7]。

1.3 观察指标

①宫颈癌不同病理类型的临床特征分布；②宫颈癌不同病理类型下HPV高危亚型表达情况；③宫颈癌不同病理类型E6、E7、P53和Rb蛋白表达情况；④HPV高危亚型与E6、E7、P53和Rb蛋白表达的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验；亚型与蛋白表达的相关性采用Spearman相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌不同病理类型的临床特征分布

病理学结果显示，120例宫颈癌患者腺癌34例，鳞癌86例，宫颈癌不同病理类型下年龄、卡氏评分、FIGO分期、组织学分级和病灶大小等临床特征分布比较，差异均无统计学意义（P>0.05）（表 1）。

表1 宫颈癌不同病理类型的临床特征分布（例）

2.2 宫颈癌不同病理类型患者HPV高危表型分布

宫颈腺癌以HPV 18亚型为主，占64.71%，其中单一感染27例，多重感染7例，多重感染率为20.59%；宫颈鳞癌以HPV 16亚型为主，占62.79%，其中单一感染81例，多重感染5例，多重感染率为5.81%。宫颈腺癌的HPV 18亚型占比高于鳞癌，HPV 16亚型占比低于鳞癌，且宫颈腺癌的多重感染率高于鳞癌，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。宫颈鳞癌及腺癌患者中均无HPV 31型、HPV 35型、HPV 51型。

表2 宫颈癌不同病理类型患者HPV高危表型分布[n（%）]

2.3 宫颈癌不同病理类型E6、E7、P53和Rb蛋白阳性表达率的比较

蛋白免疫组化检测结果显示，宫颈腺癌和鳞癌E6蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；而宫颈腺癌E7蛋白表达高于宫颈鳞癌，P53和Rb蛋白表达低于宫颈鳞癌，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 3）。

表3 宫颈癌不同病理类型E6、E7、P53和Rb蛋白阳性表达率的比较[n（%）]

2.4 宫颈癌患者 HPV 16、HPV 18 亚型与 E6、E7、P53和Rb蛋白表达的相关性分析

结果显示，宫颈癌患者HPV 16亚型、HPV 18亚型与E6、E7、P53和Rb蛋白阳性表达均呈正相关（P＜0.05）（表 4）。

表4 宫颈癌患者HPV 16、HPV 18亚型与E6、E7、P53和Rb蛋白表达的相关性分析

3 讨论

现已证实，HPV感染是宫颈上皮内瘤变、宫颈癌发生的关键因素，高危型HPV持续感染在宫颈癌及癌前病变发生发展中扮演重要角色[8]。宫颈癌患者HPV感染率较高，已被临床广泛重视，且随着检测技术的提高，HPV分型的筛查和诊断广泛应用于临床，为宫颈癌发生和进展机制的分析以及临床治疗提供了基础理论和指导。

现国内外学者均证实，宫颈癌的发生与高危HPV感染密切相关，且尤以HPV 16型和HPV 18型感染为主[9-10]。研究显示[11]，HPV 16型和HPV 18型占比约为78%，HPV 16型高于HPV 18型，多重感染约为13%。本研究结果显示，120例合并高危HPV感染的宫颈癌患者中HPV 16型占比57.5%，HPV 18型占比30.83%，且多种感染率为10%，与上述研究数据基本一致。此外，本研究通过对不同病理类型宫颈癌进行对比分析结果显示，宫颈腺癌的HPV 18亚型占比高于鳞癌，HPV 16亚型占比低于鳞癌，且宫颈腺癌的多重感染率高于鳞癌（P＜0.05），此差异可能影响患者病情进展与预后状态。

国外学者Clifford等[12]报道宫颈鳞癌以HPV 16感染为主，而宫颈腺癌以HPV 18为主。张玲等[13]对我国52例宫颈腺癌HPV检测显示宫颈管型腺癌及子宫内膜样腺癌中HPV l6/18的感染率均较高，在宫颈腺癌中HPV 16及HPV 18的感染率大致相当。本研究中宫颈腺癌以HPV 18亚型为主（64.71%），宫颈鳞癌以HPV 16亚型为主（62.79%），与Clifford等研究结论基本一致，此外，本研究中宫颈腺癌HPV 16亚型和HPV 18亚型感染率分别为41.18%和64.71%，与张玲研究中宫颈腺癌中HPV16及HPV18的感染率大致相当结论大致相符。现临床证实，宫颈腺癌预后状态较宫颈鳞癌差，相关机制尚未完全明确[14]，根据本研究HPV 16及HPV 18亚型分布可以推测HPV 18型感染不仅与腺癌的发生有关，可能影响病情的进展和预后。

E6和E7为HP基因早期区E中重要的非结构蛋白，在细胞永生化和恶性转化中起到关键性作用，抑癌蛋白P53和磷酸化的Rb蛋白则是二者分别对应的接合位点，使后者失活引起细胞永生化，促进细胞的恶性进展[15-16]。E6蛋白结合P53并通过多种作用机制使P53失活，不仅抑制P53蛋白表达，并且引起细胞G1/S检测点失活，使细胞周期失控，引起细胞永生化[17]。E7蛋白与Rb蛋白结合，激活转录因子E2F导致Rb-E2F复合体解离，使其凋亡作用减弱或丧失，促进恶性细胞的发生与发展[18]。本研究中120例宫颈癌患者E6、E7蛋白表达水平均较高，P53和Rb蛋白相对较低，对不同病理类型的宫颈癌患者进行对比分析发现，宫颈腺癌和宫颈鳞癌E6蛋白均呈高表达，但二者无显著差异（P＞0.05）；而宫颈腺癌E7蛋白表达高于宫颈鳞癌，P53和Rb蛋白表达低于宫颈鳞癌，不同病理类型比较差异有统计学意义（P＜0.05）。P53和Rb蛋白表达与E6、E7蛋白表达水平呈负相关，E6、E7致癌蛋白分别与P53和Rb蛋白结合，导致二者含量和表达水平下调，且在宫颈腺癌中E7表达水平高于宫颈鳞癌，有研究显示[19]，E7表达可明显增加E6介导人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）转录能力，提示 E6 介导hTERT转录可能受到E7表达的限制和影响，而E7和hTERT在细胞永生化机制中具有协同作用。本研究Spearman相关性分析结果显示，宫颈癌患者HPV 16亚型、HPV 18亚型与E6、E7、P53和Rb蛋白阳性表达均为正相关（P＜0.05），且宫颈癌患者HPV 16亚型和HPV 18亚型与E7相关性系数存在显著差异（P＜0.05），表明E6和E7的高共表达率可能是宫颈腺癌预后不良的重要因素。

综上所述，宫颈鳞癌高危HPV亚型以HPV 16型为主，宫颈腺癌高危HPV亚型以HPV 18型为主，且宫颈鳞癌和腺癌E7、P53和Rb蛋白阳性表达存在较大差异，宫颈腺癌较高多重感染率和E6、E7较高的共表达率可能是影响预后不良的重要因素，值得进一步研究探讨。