Claudin-1、E-cad、CyclinD1和 nm23在不同分化肺腺癌中的表达及临床意义

杨百路 李紫艳 张艳薇 谢 勇 曹 玓 柏青杨▲

1.齐齐哈尔医学院基础病理教研室，黑龙江齐齐哈尔 161000；2.内蒙古医科大学第一临床医学院，内蒙古呼和浩特 010000

作为全球范围内发病率及死亡率最高的肿瘤，肺癌居恶性肿瘤之首，严重影响人民的健康和生命。由于精准医学的发展，尽管近年来肺癌的治疗效果不断提高，但5年生存率仍徘徊在15%左右。目前，靶向治疗为肺癌治疗研究的热点。越来越多分子靶点的发现与靶向药物的研发使肺癌的治疗取得了很大进展[1-3]。精准的医学模式是目前肿瘤治疗的趋势和方向，主要利用有效的分子生物标志物，区分目标人群，实行个体化治疗。因此，探究肺癌的新有效分子生物学标志物与潜在治疗靶点显得尤为重要。随着人类基因组计划的完成，肺癌在基因层面上有了新的认识。基因分子水平认为肺鳞癌与肺腺癌是“两种疾病”。有资料表明在肺腺癌可能更容易发现分子生物学标志物[4]。

Claudins是构成紧密连接的主要骨架蛋白，Claudins在多种肿瘤组织中表达水平明显比周围正常组织中高，并且肿瘤级别越高、淋巴结转移越容易发生，表达水平越高[5-6]。E-钙黏附素（E-Cadherin，E-cad）是黏附分子中钙离子依赖的细胞黏附素家族，有抑制肿瘤转移的作用，当E-cad表达降低或不表达，细胞间相互黏附力下降，更容易造成细胞分散并向外周浸润性生长[7]。近年来的研究结果显示，肿瘤转移抑制基因23（non-metastatic 23，nm23）可以通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤转移[8]。CyclinD1是一类蛋白家族，与细胞周期有关，其表达水平随着细胞周期变化，参与干细胞自我更新，促进细胞周期进程，能与基因特异性结合，调节多种基因表达，并且还能促进细胞增殖[9]。本实验利用免疫组织化学染色的方法研究紧密连接蛋白-1（以下简称“Claudin-1”）、E-cad、nm23、CyclinD1在肺腺癌中的表达情况及与分化程度的关系，可为肿瘤的进展及潜在治疗靶点的研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年3月至2017年3月齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心收治的60例肺腺癌手术患者的癌组织和癌旁正常组织切除标本作为研究对象。患者手术前均未接受放、化疗及其他抗肿瘤药物治疗。病理学分级：高分化腺癌18例，其中男6例，女12例；中分化腺癌32例，其中男12例，女20例；低分化腺癌10例，其中男4例，女6例。本研究经医院医学伦理委员会批准，参与研究者知情同意。纳入标准：①尚未接受治疗的肺腺癌患者；②参与研究者知情同意。排除标准：①检测结果为阴性；②其他组织类型的肺癌患者。

1.2 材料

Claudin-1、E-cad、nm23、CyclinD1 抗体[基因科技（上海）股份有限公司]，UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒 （鼠/兔）（福州迈新生物科技开发有限公司），二甲苯、乙醇、PBS液、过氧化氢液、苏木素、蒸馏水、树胶封片剂等，不锈钢高压锅、显微镜、全自动石蜡包埋机、切片机。

1.3 方法

1.3.1 石蜡切片制作 每例切片5～6张，厚度5 μm，捞片于防脱载玻片，置于37℃温箱烘干。

1.3.2 HE染色 选取每例石蜡切片1张，进行苏木素-伊红染色。

1.3.3 免疫组织化学染色采用ABC法进行Claudin-1、E-cad、CyclinD1和 nm23染色。

1.4 观察指标及评价标准

Claudin-1在细胞膜和胞质阳性表达，E-cad在胞膜阳性表达，nm23在胞质阳性表达，CyclinD1在胞核阳性表达。阳性结果判定标准：肿瘤细胞的胞膜、胞质或胞核呈黄色至棕褐色为阳性染色。高倍镜下随机选取10个视野，结合染色强度和阳性细胞数量进行判定[10]。染色强度按切片中细胞着色的深浅评分：细胞无显色为0分；黄色为1分；2分为棕黄色；3分为棕褐色。阳性细胞数量按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：0%～＜5%为0分；5%～＜25%为1分；25%～＜50%为2分；50%～＜75%为3分；75%以上为4分。上述两项评分的乘积作为总积分：0分为阴性（-）；1～4分为弱阳性（+）；5～8 分为中等程度阳性（2+）；≥9分为强阳性（3+）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学检查结果

显微镜下观察HE染色切片用于检测病理诊断结果，根据镜下腺癌形态判断分化程度：贴壁型为高分化18例，腺泡型、乳头型为中分化32例，微乳头型、实性型为低分化10例。

2.2 免疫组化染色结果

实验组的E-cad、nm23的表达低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组的 CyclinD1、Claudin-1的高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；高、中分化腺癌中E-cad、nm23的表达高于低分化，差异有统计学意义（P<0.05）。高、中分化腺癌中CyclinD1、Claudin-1的表达低于低分化，差异有统计学意义（P<0.05）（表 1；图 1，封三）。

图 1 Claudin-1、E-cad、nm23、Cyclin D1 在肺腺癌中的表达（IHC 染色，200×）（见内文第 39页）

3 讨论

细胞黏附既能维持组织结构稳定，也能调节细胞运动和发挥功能，并对细胞增殖、分化有重要影响。黏附、降解和移动是肿瘤发生侵袭的三步曲，同时肿瘤细胞向周围组织侵袭和转移必须穿过细胞外的基质屏障、血管壁基底膜才能进入宿主微循环。

细胞的黏附结构以Claudins最重要，其改变可以影响紧密连接的结构和功能。这种改变可以是Claudins数量上改变，也可以是基因突变。E-cad是介导钙依赖性上皮细胞黏附的最主要分子，介导同种细胞间连接，使得肿瘤细胞保持密切联系从而难以脱离原发灶。E-cad蛋白的功能或表达缺失时，肿瘤细胞间的黏附作用减弱从而获得侵袭能力。目前肿瘤组织中Claudins的过表达机制正在研究中，研究结直肠癌组织Claudin-1的过表达机制时发现，Claudin-1的过表达可以抑制E-cad表达，失去E-cad表达使E-cad/Tcf信号通路上调。Claudin-1在细胞膜上定位改变、E-cad表达减少、E-cad/Tcf信号通路上调共同作用促进肿瘤发生发展。有研究发现Claudin-1在人类原发性结肠癌中表达上调，抑制Claudin-1的表达后可增加E-cad的转录，从而提示Claudin-1可促进细胞转化、肿瘤生长和转移[11]。有研究发现Claudin-1在肺腺癌中的阳性表达与预后差有关[12-14]。本研究结果显示，高、中分化腺癌中E-cad、nm23的表达高于低分化，差异有统计学意义（P<0.05）。高、中分化腺癌中CyclinD1、Claudin-1的表达低于低分化，差异有统计学意义（P<0.05）。E-cad在肺腺癌表达降低，在高中分化肺腺癌与低分化肺腺癌的表达比较，差异有统计学意义（P<0.05）。nm23基因是肿瘤细胞重要转移抑制基因，对癌细胞的运动与转移有明显抑制作用，主要通过参与G蛋白调控跨膜信息传递，从而对细胞分化及癌基因转化起作用，其表达高低与肿瘤病理学分级和淋巴结转移能力相关[15]。CyclinD1在肺癌的发生发展中起关键作用[16]，可作为判断肿瘤分化程度的指标，可能在肺癌发生过程中较早发生，具有早期诊断价值[17]。在肺腺癌组织，Claudin-1、CyclinD1的表达增高，从高分化到低分化，其过表达率均呈上升趋势，而E-cad、nm23的表达率均呈降低趋势。Claudin-1、CyclinD1、E-cad与nm23可能参与了正常细胞的生长发育及肺腺癌的发生发展。

综上所述，Claudin-1、E-cad、nm23、CyclinD1 在肿瘤的发生、发展中相互拮抗，从而影响肿瘤的演进，可作为组织学分型、临床分期和预后判断的辅助指标。可行性较高，值得在基层医院推广。