高海拔不同温度下溺死雄性大鼠玻璃体液内维生素C、次黄嘌呤、谷草转氨酶和尿素的浓度变化与早期死亡时间的关系※

赵 海，于 聪，赵洪乾，李 婷，凌 云，齐佳瑞，陈 亮，吴 岳#

( 1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.青海省刑事警察总队，青海 西宁 810001)

利用玻璃体液内物质浓度的变化推断死亡时间(postmortem interval，PMI)是近年来的研究热点。本课题探讨在高海拔、不同温度(T)下雄性大鼠溺死后玻璃体液(vitreous humor，VH)中的维生素C(Vit.C)、次黄嘌呤(Hx)、谷草转氨酶(AST)和尿素(Urea)的浓度变化与早期PMI的关系。

1.材料与方法

1.1 实验动物分组及取材方法

1.2 样本检测方法

检测之前将样本在室温下解冻，取玻璃体液200 μL于检测管中，使用美国贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析检测仪检测AST、Urea浓度。用移液枪吸取50 μL玻璃体液于上样瓶中，应用安捷伦1260 Ⅱ高效液相色谱仪检测Vit.C、Hx浓度。

1.2.1 高效液相实验体系

1.2.2 实验标准品的制备方法

Hx的相对分子质量为136.11，用电子天平称量Hx的标准品，用移液枪提取纯水配置0.100、0.050、0.010、0.005mg·mL-1的标准品，用水浴加热溶解。Vit.C的相对分子质量为176.12，用电子天平称量Vit.C的标准品，用移液枪提取纯水配置0.200、0.100、0.050、0.025mg·mL-1的标准品。

1.2.3 Hx标准品高效液相色谱图

Hx标准品高效液相色谱图见图1。

1.2.4 Vit.C标准品高效液相色谱图

Vit.C标准品高效液相色谱图见图2。

图2 VC标准品高效液相色谱图

1.3 统计学方法

实验数据采用SPSS19.0统计软件进行均数及标准差计算、单因素方差分析、Pearson及多元线性回归方程分析，检验水准为α=0.05。

2.结果

2.1 玻璃体液内的AST浓度

大鼠死亡后在不同T条件下，随着PMI的延长VH中AST的变化如表1与图3所示。与对照组相比随着PMI的延长AST浓度呈现先上升后下降的趋势(P<0.05)。0到6 h内AST呈上升趋势，增长率分别为236%、189%、233%，随T上升，AST浓度增长速度先降低后升高。其中0到3 h内上升最快，图3显示其斜率最大。4 ℃组在9 h时上升至最高点，此后逐渐下降，而20 ℃组与30 ℃组则在6 h时开始下降。在死亡9至24 h内AST的浓度在同一时间降低，其中4 ℃温度组下降速度较平缓，而另外两组下降速度更快且随着T的升高下降速度增加，下降速度与T成正比。

表1 大鼠死后不同温度玻璃体液AST浓度的测定结果

2.2 玻璃体液内的Urea浓度

大鼠死亡后在不同T条件下，随着PMI的延长VH中Urea的变化的如表2与图4所示。与对照组相比随着PMI的延长Urea浓度呈现先上升后下降的趋势(P<0.05)。在0到3 h内浓度逐渐上升，20 ℃组增长速度最快，图4显示其斜率最大，三个温度组在其间的增长速度分别为150%、411%、213%，随着T升高呈现先增高后降低的趋势。Urea浓度在6、9、12、18、24 h下降，其中6至9 h内下降速度最快，下降速度随着T升高呈现先增高后降低的趋势。在9至12 h内出现短暂平台期，图4显示其浓度波动很小，此后浓度逐渐下降且下降速度近乎相同，图4显示其图线几乎平行。

图4 大鼠死后不同温度及时间下玻璃体液中Urea浓度变化图

表2 大鼠死后不同温度玻璃体液Urea浓度的测定结果

2.3 玻璃体液内的Hx浓度

以Hx标准品浓度为横坐标、标准品峰面积为纵坐标，得出标准品方程为y=27.408x-33.709，r2=0.9952，由此可推出玻璃体液中Hx的浓度。大鼠死亡后在不同T条件下，随着PMI的延长VH中Hx的变化如表3与图5所示。与对照组相比随着PMI的延长Hx浓度呈现先降低后上升再降低的趋势(P<0.05)。在死亡0至3 h内Hx下降速度最快，图5显示其斜率变化最大，随着温度增高Hx浓度降低。4 ℃组与20 ℃组相比变化趋势相同，0至9 h内浓度逐渐下降，9至18 h内浓度逐步升高后继续下降，浓度变化的速率与温度成正比。30 ℃组3 h时浓度降至最低点，3至9 h内浓度逐渐升高，上升阶段相比最低点增长率为14%，而4 ℃组与20 ℃组则分别为34.4%与79.8%，上升速度随着T增加呈现先上升后下降的趋势，此后浓度再次下降，但在12 h之后浓度变化幅度较小，图5显示该时间段曲线趋于平缓。

图5 大鼠死后不同温度及时间下玻璃体液中Hx浓度变化图

表3 大鼠死后不同温度玻璃体液Hx浓度的测定结果

2.4 玻璃体液内的Vit.C浓度

以Vit.C标准品浓度为横坐标、标准品峰面积为纵坐标，得出标准品方程为y=14.831x-46.843，r2=0.9998，由此可推出玻璃体液中Vit.C的浓度。大鼠死亡后在不同T条件下，随着PMI的延长VH中Vit.C的变化如表4与图6所示。与对照组相比，随着PMI的延长Vit.C的浓度呈现先降低后上升再降低的趋势(P<0.05)。在死亡0至3 h内Vit.C下降速度最快，图6显示其斜率变化最大，下降速度与T成反比。4 ℃组与20 ℃组在3至12 h内浓度波动幅度较小，图6显示该时间段逐渐平缓，12至18 h内浓度逐渐上升，相比于最低点增长率分别为45%、73%；30 ℃组在6 h时上升至最高点增长率为19%，此后浓度逐渐下降，12 h后趋于平缓。在早期死亡时间内，Vit.C的上升幅度随T的增加呈现先升高后降低的趋势。

图6 大鼠死后不同温度及时间下玻璃体液中Vit.C浓度变化图

表4 大鼠死后不同温度玻璃体液Vit.C浓度的测定结果

2.5 相关分析结果

Pearson分析结果见表5。

表5 PMI与浓度值的Pearson分析结果

2.6 曲线拟合相关分析结果

将不同T条件下的AST、Urea、Hx、Vit.C的浓度与PMI进行相关分析，其中以测定值为因变量y、PMI为自变量x作曲线相关拟合(二次、三次、复合曲线)得到的结果如表6所示。其中Urea、Vit.C在20 ℃时r2相对较高，说明在20 ℃时其与PMI相关性更好；AST、Hx在30 ℃时r2更高，说明在30 ℃时其与PMI相关性更好。综上所述，在温度为4 ℃时Vit.C的三次回归方程r2较大，与PMI相关性更好；20 ℃时，Urea的三次回归方程r2较大，用于PMI推断更加准确；30 ℃时Hx的三次回归方程r2较大，更适合用于PMI推断。

表6 PMI与浓度值的回归分析结果

3.讨论

玻璃体液由水、蛋白质、无机盐、脂质、尿素、葡萄糖、维生素等物质组成。因眼球解剖位置独特，不容易受到污染，近年来拟通过玻璃体液内物质浓度的变化，探讨与PMI关系的研究成为热点[1]。因PMI推断的指标物质在死后受众多因素影响，在众多影响因素中，外界温度被认为是影响PMI推断的最主要因素[2-4]。Ahra Go等[5]对已知PMI的尸体的VH进行了定量分析，同时用四季温度进行分组并调查每个样本死亡时的平均日环境温度以校准与PMI的相关性，结果显示Hx与PMI的相关性从0.53增加到0.59，L-乳酸的相关性从0.38增加到0.42。Rognum等[6]检测尸体玻璃体液中的Hx浓度，显示Hx的浓度与PMI呈正相关关系，显示环境温度对玻璃体液内的Hx浓度有较大影响。以上研究表明构建不同温度条件下与PMI之间的多元回归方程，可以提高其推测精确度。

西宁市海拔为2 261 m，属于高海拔地区，早晚温差大，气候特征与内陆差异大需要进行差异化研究[7]。本实验选择常见低温(4℃)、常温(20℃)、高温(30℃)进行实验。

实验结果显示，溺死的雄性大鼠VH中AST、Urea、Vit.C、Hx的浓度与PMI呈负相关关系。其中Urea，Vit.C在20 ℃时三次回归曲线拟合优度相对较高，分别为0.950、0.782，说明在20 ℃时该物质的浓度变化与PMI的相关性更高；AST、Hx在30 ℃时拟合优度更高，AST的复合回归曲线拟合优度为0.541，Hx三次回归曲线拟合优度为0.762，说明在30 ℃时与PMI相关性更好。对于拟合优度，不同专业领域的人的要求不同，在对于玻璃体液成分代谢与PMI的关系中，有学者[8-9]认为具有应用价值的相关回归方程其拟合优度要大于0.9。在本实验中只有20 ℃条件下的Urea满足，拟合优度为0.950>0.900。三个温度组中Urea的Pearson分析结果皆大于0.7，属于强相关，并且实验中发现死后Urea前期的上升与T的升高造成VH内蛋白质代谢致氨增多有关，呈现先上升后下降的趋势，至9 h时基本下降至同一水平，而后至24 h时随着T的升高，三组Urea的图线呈现平行状态，即9 h后T的变化并不能改变Urea的代谢速率。但由于未能考虑到环境湿度、死前损伤状况、个体化差异等因素，其可能存在误差。

综上所述，高海拔环境下不同T对推断溺死雄性大鼠的PMI有影响，Urea的三次回归方程更适合20 ℃环境下对于PMI的推断，Vit.C、AST、Hx也随着PMI的延长呈现下降趋势，可用作综合推断指标。大鼠与人的个体化差异明显，相关规律能否应用于人体犹未可知。