三七总皂苷和灯盏花素单用与联用时主要成分的药动学比较

孙韬华，闫泰山，黎维勇，陈安进

(1.青岛市市立医院药物临床试验研究科，青岛 266011；2.青岛市市立医院药学部，青岛 266011；3.华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科，武汉 430022)

三七总皂苷为五加科植物三七的主根或根茎经加工制成的总皂苷，2015年版《中华人民共和国药典》中，以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd进行三七总皂苷的鉴定和含量测定[1]。三七总皂苷的制剂在临床上应用广泛，其中三七总皂苷粉针可用于瘀血阻络、卒中偏瘫等症。灯盏花素是从菊科植物短葶飞蓬中提取分离所得干燥粉末，其主要有效成分为野黄芩苷[1]，灯盏花素粉针在临床上用于卒中及其后遗症等的治疗。从适应证来看，三七总皂苷粉针和灯盏花素粉针具有相近之处。前期动物实验表明，三七总皂苷和灯盏花素联合应用，具有改善急性心肌缺血[2]、急性脑缺血症状[3]等功效，可以显著降低脑梗死大鼠血清中诱导一氧化氮合酶的活力及总一氧化氮合酶的含量，与单药组相比有明显差别[4]。这一结果提示可对两者联合用药进行进一步研发。本实验中，考察了二者制成的复方粉针(下文中简称为：复方粉针)在健康比格犬体内的药动学特征，并与单方制剂三七总皂苷粉针和灯盏花素粉针进行比较。

1 材料与方法

1.1实验动物 比格犬30只，雌、雄各半，体质量(10.83±0.68) kg，安陆瑞克森实验动物场提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2008-0001。使用许可证号：SYXK(鄂)2010-0057。饲养于普通级环境，室温18～29 ℃，相对湿度30%～75%，室内光照明暗交替各12 h，单笼饲养，普通饲料投喂，自由饮用净化水。

1.2药品与试剂 三七皂苷R1(含量98.0%，批号：110745-200617)、人参皂苷Rg1(含量96.3%，批号：110703-201027)、人参皂苷Re(含量88.8%，批号：110754-200822)、人参皂苷Rb1(含量92.6%，批号：110704-200921)、人参皂苷Rd(含量94.4%，批号：111818-201001)、野黄芩苷(含量96.4%，批号：110842-200102)及内标替米沙坦(含量99.3%，批号：100629-200401)对照品均购自中国食品药品检定研究院。复方粉针(规格：每支含三七总皂苷125 mg，野黄芩苷5 mg，批号：20120816)、三七总皂苷粉针(规格：三七总皂苷125 mg/支，批号：20121023)、灯盏花素粉针(规格：野黄芩苷5 mg/支，批号：20121101)均由丽珠医药集团股份有限公司研制。色谱纯甲醇、乙腈购自德国Merck公司；色谱纯乙酸铵购自广州迪马公司；实验用水为超纯水。

1.3仪器与设备 LC-30AD型液相色谱系统，QTRAN 5500型三重四极杆串联质谱仪；梅特勒AB-265S型精密天平(感量：0.01 mg)；XW-80A微型涡旋混合仪；Thermo BR4i型高速离心机；ANNEL DC-12氮吹仪；UNT优普超纯水机。

1.4动物分组、给药和血样采集 30只健康比格犬采用SAS9.4编写随机程序，按照1：1：1随机分成复方粉针组、三七总皂苷粉针组和灯盏花素粉针组，分别静脉注射复方粉针8.67 mg·kg-1，三七总皂苷注射液8.33 mg·kg-1，灯盏花素注射液0.33 mg·kg-1。复方粉针及三七总皂苷粉针组：于给药前及给药结束后2，5，10，15，20，30，40，50 min，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8，12，24，36，48，72，96，120，168 h采血；灯盏花素粉针组：给药前及给药后2，5，10，15，20，30，40，50 min，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8 h采血。血样置于肝素抗凝试管中，采血后立即4 ℃，3000 r·min-1离心10 min(r=17 cm)，取上清液于-80 ℃保存待测。

1.5色谱与质谱条件 色谱条件 Ultimate Polar-C18色谱柱(2.1 mm ×100 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-20 mmol·L-1乙酸胺溶液(B)，梯度洗脱，洗脱程序详见表1。流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；样品箱温度：4 ℃；进样体积：5 μL。

表1 6种组分的洗脱程序 Tab.1 Elution program for six components

质谱条件：电喷雾电离源，负离子模式，多反应离子监测；离子源电压为-4500 V，温度为600 ℃，监测离子对分别为：三七皂苷R1m/z931.60→475.40，人参皂苷Rg1m/z799.50→637.50，人参皂苷Rem/z945.60→475.50，人参皂苷Rb1m/z1107.70→945.60，人参皂苷Rdm/z945.60→621.50，野黄芩苷m/z461.10→285.10，替米沙坦m/z513.30→469.30。

1.6血浆样品的处理 取血样0.2 mL，加入亚硫酸氢钠(1 mol·L-1)和内标工作液(替米沙坦1.15 μg· mL-1)各30 μL，加入甲醇0.6 mL；涡旋1 min后，15 000 r·min-1离心10 min(r=8.4 cm)，取上清液5 μL进样分析。

1.7标准溶液的配制 对照品溶液的配制：精密称取各对照品适量，用甲醇溶解定容，制成的储备液浓度分别为三七皂苷R1239.32 μg· mL-1，人参皂苷Rg1235.16 μg· mL-1，人参皂苷Re 197.49 μg· mL-1，人参皂苷Rb1244.65 μg· mL-1，人参皂苷Rd 1.247 mg· mL-1，野黄芩苷214.59 μg· mL-1。分别取上述6 种成分的对照品储备液3.34，5.74，1.52，8.17，7.21，4.66 mL，分别用甲醇定容至10 mL，再经甲醇系列稀释7个梯度，得线性范围项下各对照品溶液浓度。

内标溶液的配制：精密称取替米沙坦对照品(含替米沙坦11.43 mg)11.51 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到228.6 μg· mL-1替米沙坦储备液，置于-20 ℃冰箱保存。用甲醇将替米沙坦储备液稀释至1150 ng· mL-1的内标工作液备用。

1.8质量控制样品的配制 取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、野黄芩苷的低、中、高浓度质量控制溶液各20 μL，混匀后氮气吹干，加入空白犬血浆200 μL，配制各浓度质量控制样品。各组分质量控制样品的浓度详见表2。

表2 6种组分的质量控制样品浓度 Tab.2 Concentration of quality control for six components ng· mL-1

2 结果

2.1特异性 在本实验条件下，各色谱峰峰形良好，分离完全。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、野黄芩苷和内标的保留时间分别约为2.73，3.56，3.54，3.91，4.75，2.21和4.36 min。见图1。

A.三七皂苷R1；B.人参皂苷Rg1；C.人参皂苷Re；D.人参皂苷Rb1；E.人参皂苷Rd；F.野黄芩苷；G.替米沙坦。图1 复方粉针给药10 min后比格犬血样色谱图 A.notoginsenoside R1；B.ginsenoside Rg1；C.ginsenoside Re；D.ginsenoside Rb1；E.ginsenoside Rd；F.scutellarin；G.telmisartan.Fig.1 Chromatogram of plasma sample from Beagles 10 min after the administration of compound injection

2.2标准曲线 取三七总皂苷各组分及野黄芩苷各浓度标准溶液各20 μL，混匀后氮气吹干，加入空白犬血浆200 μL，配制成各浓度模拟血浆样品，按照“1.6”项下操作，以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W=1/X2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。结果表明血浆中以上6种成分线性关系良好。各组分标准曲线范围及典型线性方程见表3。

表3 6种组分的典型方程和线性范围 Tab.3 Linear equation and linear range for six components

2.3准确度、精密度 质量控制按照“1.6”项下操作，每一浓度进行5份样本分析，连续测定3 d，根据当日的标准曲线，计算质量控制样品的测得浓度，根据质量控制样品结果计算准确度与精密度。经测定3个浓度下三七皂苷R1等6种组分的日内和日间精密度的相对标准偏差(RSD)最大值为10.07%，低、中、高浓度下各检测成分质量控制的准确度相对误差(RE)最大值为-8.03%。结果见表4。

2.4提取回收率和基质效应 质量控制按照“1.6”项下操作，每一浓度进行5份样本分析，获得相应峰面积(A1)；于EP管中加入各组分低、中、高浓度质量控制溶液20 μL以及内标溶液(1150 ng· mL-1) 30 μL，混匀后氮气吹干；同时取5份不同来源空白犬血浆200 μL，除不加质量控制溶液和内标溶液外，按“1.6”项下操作，然后尽取上清液，加入到前述EP管内，取上清液进样分析，获得相应峰面积(B1)；取各组分低、中、高浓度质量控制溶液各20 μL以及内标溶液30 μL，混匀后氮气吹干，加入纯化水200 μL，加入甲醇0.6 mL；涡旋1 min后，15 000 r·min-1离心10 min(r=8.4 cm)，取上清液进样分析。获得相应峰面积(C1)。以A1/B1计算提取回收率，以B1/C1计算基质效应。结果显示，在低、中、高浓度下，各组分提取回收率稳定；血浆基质对各组分的测定无影响。结果见表4。

2.5稳定性 考察各组分低、中、高浓度质量控制的室温(室温放置2 h)，处理后4 ℃放置2 h，冻融(冻融循环3次)及长期稳定性(-80 ℃冷冻下放置54 d)。经测定，4种情况下得到的6种组分的峰面积与零时间点的偏差均在15%以内，提示实验条件下血浆样品稳定性良好。结果详见表4。

表4 方法学验证结果 Tab.4 Validation results of the methodology %，n=5

2.6药动学结果 以DAS 2.1.1版软件计算相关的药动学参数，复方粉针组、三七总皂苷粉针组及灯盏花粉针组各组分的相关的药动学参数结果见表5。其中除血浆消除半衰期(t1/2)、浓度-时间曲线下面积(AUC0-∞)外，达峰时间(tmax)、峰浓度(Cmax)为实测值。复方粉针组与三七总皂苷粉针组中多种组分Cmax差异有统计学意义，包括三七皂苷R1(P<0.05)，人参皂苷Rg1(P<0.01)，人参皂苷Re(P<0.01)和人参皂苷Rd(P<0.01)。

表5 复方粉针、三七总皂苷粉针、灯盏花素粉针各组分的药动学参数 Tab.5 Pharmacokinetic parameters of each component in compound injection，notoginseng total saponins for injection and breviscapine for injection

3 讨论

笔者建立了检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb、人参皂苷Rd、野黄芩苷在比格犬血浆中浓度的液质联用方法。该方法专属性好，检测结果稳定可靠。

实验结果表明，二醇型皂苷(人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd)和三醇型皂苷(三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re)在比格犬内药动学参数差异较大：三醇型皂苷的血药浓度从2 min的峰浓度迅速下降，呈快速的分布及消除特征；二醇型皂苷的血药浓度下降缓慢，其t1/2远大于三醇型皂苷，表明二醇型在血中分布较慢，在体内滞留时间长，可能与人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的血浆蛋白结合率较高有关[5]。野黄芩苷的血药浓度呈快速下降趋势，在体内快速分布，消除较快，静脉注射给药后2 h血浆浓度已低于10 ng· mL-1，表明野黄芩苷在比格犬体内滞留时间较短。

复方粉针与三七总皂苷粉针或灯盏花素粉针单用相比，人参皂苷Rb1和野黄芩苷的峰浓度Cmax未见显著性差异，但三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd的Cmax显著性升高。三七总皂苷粉针和灯盏花素粉针及复方粉针单次给药的血药浓度-时间曲线相似，主要药动学参数包括t1/2、AUC0-∞差异无统计学意义(P>0.05)，表明两者联合用药可提高三七总皂苷部分组分的Cmax，但对野黄芩苷的药动学没有明显影响。

三七总皂苷具有显著缓解脑缺血再灌注损伤的作用，其机制可能与降低血清一氧化氮含量[6]、改善脑组织血流供应[7]等有关；灯盏花素注射液对急性缺血再灌注脑损伤亦具有明显的保护作用，其机制可能涉及改善脑血流量和减少脑组织中n6多不饱脂肪酸的含量等[8]。两者作用机制上是否会叠加或互补从而引起协同作用，尚需研究验证。本研究中发现联合使用仅能增加部分组分的Cmax，对AUC0-∞没有显著影响，协同作用是否与Cmax的增加相关亦需进一步考察。

本研究中，在确定比格犬给药剂量时，根据三七总皂苷粉针和灯盏花素粉针的临床推荐剂量，采用了按体表面积直接转换法、按mg·kg-1折算mg·(m2)-1转换因子计算法、按照每千克体质量占体质量表面积相对比值计算法、按照人与各种动物以及各种动物之间用药剂量换算法分别计算给药剂量，取最大值作为最终实验用量，以为后期人体试验研究提供更为安全的数据支持。