miR-140-3p靶向凋亡基因BAX减轻白细胞介素-1β诱导的软骨细胞损伤

王燚伟，田永利，马广恩，张永占

(秦皇岛市第一医院关节骨科，河北 秦皇岛 066001)

骨关节炎是中老年人常见的慢性退行性关节病变，病因复杂且发病机制未完全阐明，至今仍缺乏特效的治疗手段。关节软骨细胞损伤在骨关节炎的发病中起重要作用，表现为软骨细胞数量减少、细胞外基质合成及分解紊乱。近些年，微小RNA(microRNA，miR)在软骨细胞损伤中的作用受到越来越多关注，不同的miRs可能通过调控细胞凋亡、炎症反应、氧化应激等环节在骨关节炎的发病过程中引起软骨细胞损伤[1-3]。国内殷春明等[4]的一项临床研究证实，骨关节炎患者关节液中miR-140-3p的表达水平呈降低趋势，且关节病变越重miR-140-3p表达越低；Wang等[5]的研究在椎间盘退行性改变中证实miR-140-3p具有保护作用。基于此提出假设，骨关节炎发病过程中miR-140-3p起软骨细胞保护作用，其表达降低会削弱保护作用并引起或加重软骨细胞损伤。为了验证这一假设，本研究以白细胞介素(interleukin，IL)-1β诱导软骨细胞损伤模型为对象，通过细胞存活、细胞凋亡及相关基因表达的检测分析了miR-140-3p的生物学作用及机制，旨在为阐明miR-140-3p在骨关节炎发病中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 大鼠骨关节软骨细胞株ATDC5(中科院上海细胞资源中心，中国)。

1.2 试剂 IL-1β(Sigma公司，美国)；miR-140-3p及阴性对照(NC)miR、阴性对照腺病毒(Ad-NC)及过表达Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associatal X protein，BAX)的腺病毒(Ad-BAX)(上海吉凯公司，中国)；miR提取、反转录及荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测试剂盒(北京天根生化公司，中国)；四唑化合物[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]法细胞存活检测试剂盒(Biovision公司，美国)；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal dexynucleotidyl transferase dutp nick end labeling，TUNEL)凋亡检测试剂盒(上海翌圣生物公司，中国)；细胞裂解液(上海碧云天公司，中国)；BAX、裂解型Caspase-3(Cleaved caspase-3)(Abcam公司，美国)；双荧光素酶报告基因及检测系统(Promega公司，丹麦)。

1.3 仪器 细胞培养箱(Thermo公司，美国)；荧光定量PCR仪(Bio-rad公司)；显微镜(Nikon公司)；电泳系统及凝胶成像系统(Tanon公司)。

1.4 细胞培养及分组 ATDC5细胞在含有10%胎牛血清的培养基中进行贴壁培养，每2d更换1次培养基，待细胞融合达到80%时进行消化传代。传代的细胞接种在不同规格的培养板内并进行分组干预。细胞的分组干预共分入三部分，具体如下。第一部分：验证IL-1β诱导ATDC5细胞损伤模型中miR-140、BAX表达的变化，细胞分为不同剂量IL-1β组，分别用含有0、1、5、10 ng/mL IL-1β的培养基处理。第二部分：验证miR-140在IL-1β诱导ATDC5细胞损伤模型中的生物学作用，细胞分为miR-NC组、miR-NC+IL-1β组、miR-140+IL-1β组。miR-NC组转染NC miR，miR-NC+IL-1β组转染NC miR并加入IL-1β使其终浓度达到10 ng/mL，miR-140+IL-1β组转染miR-140-3p并加入IL-1β使其终浓度达到10 ng/mL。第三部分：验证BAX在miR-140减轻在IL-1β诱导ATDC5细胞损伤中的作用，细胞分为miR-NC+Ad-NC组、miR-NC+Ad-NC+IL-1β组、miR-140+Ad-NC+IL-1β组、miR-140+Ad-BAX+IL-1β组，在IL-1β处理、转染NCmiR或miR-140-3p的基础上感染NC腺病毒或BAX腺病毒。

1.5 miR-140-3p表达的检测 ATDC5细胞分组干预24 h时采用试剂盒进行细胞中miR的提取，将miR反转录为对应的cDNA，使用miR-140-3p或U6的引物配置PCR反应体系，在PCR仪上进行荧光定量PCR反应，程序为95℃预变性3 min后95 ℃ 15 s、60 ℃ 34 s，并重复40个循环，得到PCR反应的循环曲线及循环阈值(Ct)，以U6为内参、按照公式2-ΔΔCt计算miR-140的表达水平。

1.6 BAX、Cleaved caspase-3表达的检测 ATDC5细胞分组干预24 h时采用裂解液提取细胞蛋白，检测蛋白浓度，将含有30 μg蛋白的样本加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行western blot检测，先进行电泳，而后电转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜，用5%脱脂牛奶在室温封闭PVDF膜1 h，用1︰1 000稀释的BAX、Cleaved caspase-3抗体或1︰5 000稀释的β-actin抗体在4 ℃孵育PVDF膜过夜。第2天用1︰2 000稀释的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗在室温孵育PVDF膜1 h，最后在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带，根据条带的灰度值、以β-actin为内参计算BAX、Cleaved caspase-3的表达水平。

1.7 细胞存活率的检测 ATDC5细胞分组干预24 h时采用MTS法进行细胞存活率的检测，按照试剂盒说明书进行操作并在酶标仪上检测490 nm波长的吸光值，按照[(实验孔吸光值-空白孔吸光值)/(对照孔吸光值-空白孔吸光值)×100%]计算细胞存活率。

1.8 细胞凋亡率的检测 ATDC5细胞分组干预24 h时采用TUNEL法进行细胞凋亡率检测，按照试剂盒说明书进行染色操作后在显微镜下随机观察3个高倍视野，对TUNEL阳性染色细胞、4，6-二氨基-2-苯基吲哚(4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI)阳性染色细胞进行计数，而后按照[(TUNEL阳性染色细胞/DAPI阳性染色细胞)×100%]计算细胞凋亡率。

1.9 生物信息学分析 在Targetscan数据库(http：//www.targetscan.org)进行生物信息学分析，输入miR-140-3p，分析BAX中与miR-140-3p互补配对的位点。

1.10 双荧光素酶报告基因实验 首先构建含有野生型BAX基因3’UTR的双荧光素酶报告基因，根据Targetscan网站中生物信息学预测的结果，将3’UTR中与miR-140-3p互补配对的碱基进行突变，得到突变型BAX双荧光素酶报告基因。将野生型或突变型报告基因与miR-140-3p或NC miR共同转染进入ATDC5细胞，48 h后采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测萤火虫及海肾的荧光活力，计算萤火虫与海肾荧光活力的比值作为双荧光素酶报告基因的荧光活力。

2 结 果

2.1 IL-1β诱导ATDC5细胞损伤模型中miR-140-3p、BAX表达的变化 与0 ng/mL IL-1β组比较，1 ng/mL IL-1β、5 ng/mL IL-1β、10 ng/mL IL-1β组ATDC5细胞中miR-140-3p的表达水平均明显降低，BAX的表达水平明显增加，且随着IL-1β浓度的增加ATDC5细胞中miR-140-3p的表达水平逐渐降低，BAX的表达水平增加(P<0.05，见图1)。

a miR-140-3p表达比较 b BAX表达比较

2.2 miR-140-3p对IL-1β诱导ATDC5细胞损伤模型存活率及凋亡率的影响 采用荧光定量PCR检测miR-140-3p的表达水平，结果见图2a所示：与miR-NC组比较，miR-NC+IL-1β组ATDC5细胞中miR-140-3p的表达水平明显降低(P<0.05)；与miR-NC+IL-1β组比较，miR-140+IL-1β组ATDC5细胞中miR-140-3p的表达水平明显增加(P<0.05)。

采用MTS法检测存活率、TUNEL法检测凋亡率，结果见图2b～d：与miR-NC组比较，miR-NC+IL-1β组ATDC5细胞的存活率明显降低、凋亡率明显增加(P<0.05)；与miR-NC+IL-1β组比较，miR-140+IL-1β组ATDC5细胞的存活率明显增加、凋亡率明显降低(P<0.05)。

a miR-140-3p表达水平比较

2.3 miR-140-3p对IL-1β诱导ATDC5细胞损伤模型中BAX、Cleaved caspase-3表达的影响 采用Western blot检测BAX、Cleaved caspase-3的表达，结果见图3所示：与miR-NC组比较，miR-NC+IL-1β组ATDC5细胞中BAX、Cleaved caspase-3的表达水平明显增加(P<0.05)；与miR-NC+IL-1β组比较，miR-140+IL-1β组ATDC5细胞中BAX、Cleaved caspase-3的表达水平明显降低(P<0.05)。

a BAX表达水平比较 b Cleaved caspase-3表达水平比较

2.4 miR-140-3p靶向调控ATDC5细胞中BAX的表达 在Targetscan网站进行生物信息学分析，结果见图4a所示：BAX基因mRNA 3’UTR中含有miR-140-3p的结合位点；双荧光素酶报告基因检测结果见图4b～c所示：与miR-NC组比较，miR-140-3p组ATDC5细胞中野生型BAX双荧光素酶报告基因的荧光活力明显降低(P<0.05)，突变型BAX双荧光素酶报告基因的荧光活力无明显变化(P>0.05)。

a miR-140-3p靶向调节BAX的生物信息学分析

2.5 过表达BAX对miR-140-3p减轻IL-1β诱导ATDC5细胞损伤的影响 采用Western blot检测BAX、Cleaved caspase-3的表达，结果见图5a～b所示：与miR-NC+Ad-NC组比较，miR-NC+Ad-NC+IL-1β组ATDC5细胞中BAX、Cleaved caspase-3的表达水平明显增加(P<0.05)；与miR-NC+Ad-NC+IL-1β组比较，miR-140+Ad-NC+IL-1β组ATDC5细胞中BAX、Cleaved caspase-3的表达水平明显降低(P<0.05)；与miR-140+Ad-NC+IL-1β组比较，miR-140+Ad-BAX+IL-1β组ATDC5细胞中BAX、Cleaved caspase-3的表达水平明显增加(P<0.05)。

a 细胞BAX表达水平比较 b 细胞Cleaved caspase-3表达水平比较

采用MTS法检测存活率、TUNEL法检测凋亡率，结果如图2c～e所示：与miR-NC+Ad-NC组比较，miR-NC+Ad-NC+IL-1β组ATDC5细胞的存活率明显降低、凋亡率明显增加(P<0.05)；与miR-NC+Ad-NC+IL-1β组比较，miR-140+Ad-NC+IL-1β组ATDC5细胞的存活率明显增加、凋亡率明显降低(P<0.05)；与miR-140+Ad-NC+IL-1β组比较，miR-140+Ad-BAX+IL-1β组ATDC5细胞的存活率明显降低、凋亡率明显增加(P<0.05)。

3 讨 论

软骨细胞损伤在骨关节炎发病中的作用受到越来越多的关注，在软骨细胞发生损伤的过程中，细胞数量不断减少、细胞外基质持续水解，最终导致软骨弹性下降及骨赘形成[6-8]。目前，骨关节炎发病过程中软骨细胞损伤的发生机制尚不完全明确，国内外两项临床研究均证实骨关节炎患者关节液中miR-140-3p表达降低与病情加重有关[4，9]，另有miR-140-3p相关的基础研究证实该miR对椎间盘的退行性改变具有保护作用[5]。以上国内外的研究结果提示具有保护作用的miR-140-3p表达降低与骨关节炎的发病有关，本文将以miR-140-3p为切入点研究骨关节炎的发病机制。

IL-1β诱导软骨细胞损伤模型是目前研究骨关节炎发病机制常用的细胞模型，软骨细胞在IL-1β的刺激下会出现存活率降低、凋亡率增加的损伤表现[9-10]。本研究在细胞模型中检测到miR-140-3p的表达水平明显降低，与相关临床研究中miR-140-3p表达降低的结果一致。在IL-1β诱导软骨细胞损伤模型中，本研究也检测到细胞存活率降低、凋亡率增加，与既往骨关节炎细胞模型相关的研究结果[10-11]一致。为了探究miR-140-3p在IL-1β诱导软骨细胞损伤中的作用，本研究在IL-1β诱导软骨细胞损伤的过程中转染miR-140-3p使其表达增加，分析结果显示过表达miR-140-3p使细胞的存活率增加、凋亡率降低，表明miR-140-3p对IL-1β诱导软骨细胞损伤具有保护作用。

BAX是体内重要的凋亡基因，骨关节炎发病过程中软骨细胞凋亡与BAX的高表达有关。多项临床和基础研究均证实，骨关节炎患者及动物的关节软骨中BAX的表达明显增加[12-14]。本研究在IL-1β诱导软骨细胞损伤模型中BAX的表达水平增加，与既往临床和基础研究的结果吻合。BAX参与线粒体途径凋亡的调控，通过增加线粒体内细胞色素C释放启动级联反应，增加Cleaved caspase-3的表达并引起细胞凋亡[15-16]。过表达miR-140-3p后，IL-1β诱导软骨细胞损伤模型中BAX、Cleaved caspase-3的表达降低，与miR-140-3p抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡的作用吻合，也提示miR-140-3p抑制凋亡的作用可能与抑制BAX所介导的线粒体途径凋亡有关。

miRs对靶基因表达的调控作用通过识别并结合3’UTR、促进mRNA降解或阻碍mRNA的翻译来实现。本研究在Targetscan数据库进行了在线生物信息学分析，BAX基因3’UTR中含有miR-140-3p互补配对的碱基；利用双荧光素酶报告基因实验进行验证，miR-140-3p使BAX野生型报告基因的荧光活力降低，将报告基因中miR-140-3p互补配对的碱基突变后，miR-140-3p不再影响报告基因的荧光活力，由此证实miR-140-3p靶向BAX基因的3’UTR。在此基础上本研究还通过感染腺病毒、过表达BAX的方式验证了BAX在miR-140-3p减轻IL-1β诱导软骨细胞损伤中的作用，结果显示：过表达BAX后miR-140-3p使IL-1β诱导软骨细胞损伤模型存活率增加及凋亡率、Cleaved caspase-3表达降低的作用明显减弱，表明miR-140-3p的保护作用与靶向抑制BAX有关。

综上所述，miR-140-3p对IL-1β诱导软骨细胞损伤模型具有保护作用，能够增强细胞活力、抑制细胞凋亡并靶向抑制凋亡基因BAX的表达，抑制BAX介导的细胞凋亡是miR-140-3p发挥上述保护作用的相关分子机制。这为今后研究骨关节炎的发病机制、骨关节炎发病过程中软骨细胞损伤的分子机制提供了新思路和新靶点。