一种脊髓型颈椎病慢性压迫性动物模型的建立及评价

李成立，曲军杰，陈松，张为*

(1.滨州医学院烟台附属医院骨科，山东 烟台 264100；2.河北医科大学第三医院脊柱外科，河北 石家庄 050000)

脊髓型颈椎病(cervical spondylotic myelopathy，CSM)是一种以运动感觉障碍为主的常见颈椎病，病变机理为颈椎退变、韧带异常增生钙化等，导致椎管容积减少，从而继发脊髓的慢性压迫[1]。脊髓受到慢性机械压迫后可继发神经元细胞损伤、局部微循环障碍、炎症反应，从而造成脊髓的损伤性病变，出现功能障碍[2]。本研究从构建SD大鼠脊髓型颈椎病模型基础实验出发，采用聚乙烯醇-聚丙烯酰胺互穿网络水凝胶植入大鼠C5～7椎板下，建立脊髓型颈椎病慢性压迫性大鼠模型，研究脊髓不同压迫程度、不同时间点的病理学形态变化及相应节段椎间盘中相关炎症因子的表达情况，并研究炎症因子表达程度与颈椎退行性病变程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 主要实验试剂 HE 染色试剂盒(北京索来宝科技)；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal dexynucleotidyl transferase dutp nick end labeling，TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(美国，Promega Corporation)；Western blot抗体(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 实验动物与模型建立

1.2.1.1 实验动物 购入70只3个月龄健康雄性SD大鼠，从1～70编号，随机分为三组，对照组(n=10)、轻度压迫模型组(n=30)、重度压迫模型组(n=30)。SD大鼠来自河北医科大学实验动物中心。

1.2.1.2 水凝胶材料的制作 配制10%聚乙烯醇水溶液，然后用液氮进行3次冷冻-解冻，使之成凝胶态。将上述制得凝胶置于3.0 mol/L丙烯酰胺溶液中，溶胀充分后置于60Coγ射线下进行处理形成聚乙烯醇-聚丙烯酰胺互穿网络水凝胶，再将其放入10%戊二醛水溶液中浸泡30 s，重复10次浸泡烘干操作，最后将制得的水凝胶用环氧乙烷消毒后备用。

1.2.1.3 建立模型 轻度压迫模型组：通过腹腔对大鼠注射10%水合氯醛进行麻醉(3 mL/kg)，然后俯卧，并固定于手术台上。术区备皮后，碘伏反复消毒3遍后切开大鼠颈部使其C5～7椎板暴露，将椎板间韧带部分切掉，小心将1.6 mm×0.8 mm×0.4 mm尺寸水凝胶复合物放在C5～7节段的椎板下方。重度压迫模型组：重复上述操作，互穿网络水凝胶尺寸为5.5 mm×1.6 mm×0.8 mm。对照组：重复上述操作但不在椎板下植入压迫物。造模后4周、8周和12周，使用过量麻醉剂注射进入SD大鼠腹腔处死大鼠，留取C5～7整段脊髓和椎间盘进行后续研究。手术造模过程见图1。

a 暴露颈椎椎板 b 剥离椎板间黄韧带 c 植入压迫材料 d 缝合后颈椎压迫情况

1.2.2 主要观察指标 行为学评价采用改良的Rivlin斜板测试方法(见图2)。手术前和术后的第4、8和12周，对三组大鼠的运动行为能力观察。每组随机选取6只大鼠，依次放入斜板上，每只大鼠在斜板上留置10s，每只进行3次，每次记录最大倾斜角，取3次平均值，术后后4周、8周和12周对上述6只大鼠进行处死，然后取C5～7节段椎间盘和脊髓部分。脊髓HE染色、凋亡细胞检测(400倍镜下随机选择8个视野计数阳性细胞)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和Western blot对C5～7椎间盘组织内肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)-a、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-33和IL-6 mRNA水平的变化进行测定。余下大鼠作为备用，实验结束后一同处死取材。

a 对照组 b 轻度压迫模型组 c 重度压迫模型组

2 结 果

2.1 运动功能评价结果 对照组术后各时间运动功能与术前比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而轻度压迫模型组和重度压迫模型组大鼠术后8周和12周所能承受的斜板角度均显著下降，三组间差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 三组大鼠斜板爬坡试验结果

2.2 脊髓HE染色结果 术前大鼠的神经元细胞形态正常规则，髓鞘紧密排列，对应的轴突和白质均正常(见图3a～b)。术后第4周轻度、重度压迫模型组与对照组之间病理HE染色结果基本相同，细胞之间未见明显改变(见图3c～d)。术后第8周显微镜下观察轻度压迫模型组较对照组神经元细胞变性、皱缩，有轻度脱髓鞘；重度压迫模型组神经元细胞数目显著减少，可观察到显著的皱缩、脱髓鞘以及空泡发生变性(见图3e～f)。术后第12周轻度压迫模型组较对照组神经元细胞的变性程度增大，脱髓鞘加重，轴突空泡变性程度增大；重度压迫模型组神经元细胞出现坏死情况，脱髓鞘和轴突空泡变性程度加重(见图3g～h)。因此，选取对照组、术后第8周组和12周组进行后续研究。

a 轻度压迫模型组术前 b 重度压迫模型组术前

2.3 凋亡细胞检测结果 脊髓压迫组中神经元细胞的凋亡随压迫轻重和时间延长而逐渐增多，对照组中大鼠的脊髓中未观察到上述损伤改变，而且神经元细胞凋亡阳性细胞数量明显增多，且不同大鼠模型组间比较差异具有统计学意义(P<0.05，见图4，表2)。

a 对照组术后8周 b 轻度压迫模型组术后8周 c 重度压迫模型组术后8周

表2 TUNEL阳性细胞率的比较

2.4 大鼠椎间盘中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6 mRNA的变化 轻度压迫模型组和重度压迫模型组大鼠椎间盘组织中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6 mRNA表达平均高于对照组(P<0.05)，且重度压迫模型组较轻度压迫模型组表达量高(P<0.05)。此外，随着压迫时间延长，轻度、重度压迫模型组中各因子表达水平术后12周比8周明显增高，且组间比较差异有统计学意义(P<0.05，见图5)。

图5 术后8周和12周椎间盘中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6 mRNA表达水平

2.5 大鼠椎间盘中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6蛋白的变化 大鼠椎间盘中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6蛋白结果显示，轻度压迫模型组和重度压迫模型组中压迫越重及压迫时间越长，各细胞因子蛋白表达越高，椎间盘相对应的退变越严重，炎性蛋白表达越高。而且相关炎性因子的表达与压迫时间也存在正相关的关系，时间越长，相关炎性蛋白因子表达越高，组间差异有统计学上意义(P<0.05)。此外，术后8周的TNF-α蛋白相对表达量略高于12组，这可能与大鼠个体差异有关(见图6)。

图6 术后8周和12周时椎间盘中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6蛋白表达水平

3 讨 论

CSM是颈椎病中常见的一种类型[3]，建立合适的动物模型模拟人的脊髓慢性压迫的病变过程，对治疗脊髓型颈椎病尤其重要。目前，学者们选取大鼠、兔子和狗等动物进行CSM慢性压迫性模型的建立[4-5]。根据学者们的不断证实，SD大鼠颈椎构造与人的颈椎具有高度相似性，而且成本相对低，比小鼠更容易操作，因此，采用SD大鼠构建CSM慢性压迫性动物模型进行后续研究是十分理想的选择。

关于CSM慢性压迫动物模型的建立方法，学者们也进行了大量的尝试。钢钉法[6]、球囊法[4]等常被用于CSM慢性压迫性模型的建立，但这些压迫方法都存在一定缺陷。如钢钉法的钢钉进入深度不可控，球囊法压迫面积不可控，造模需要动物体积较大，导致实验成本较高，难以获得较大的标本量等缺点阻碍了在科研中的应用。随着学者们不断探索，膨胀压迫材料具有压迫方向、程度易于控制、可反复使用等优点，逐渐应用到慢性脊髓压迫颈椎病模型的建立中。其中，研究比较成熟的膨胀压迫材料多为水凝胶，且以聚乙烯醇-聚丙烯酰胺互穿网络水凝胶应用最为广泛[7-8]。因此，本研究采用该压迫材料建立慢性脊髓压迫颈椎病大鼠模型，并用于后续研究。

膨胀压迫材料因其良好的生物组织相容性，吸收椎管中组织间液的水分后体积呈线性膨胀增大，使椎管容积减少，致使脊髓受压，从而建立CSM的动物模型。先前国外有研究把一种亲水性膨胀材料植入SD大鼠颈部C5～6节段椎管后方，随着膨胀材料吸水膨胀后，位于大鼠颈部椎管内脊髓受到的压迫程度也逐渐增加，成功模拟出了脊髓颈椎病受压的模型[9-10]。国内王军[11]通过改变吸水膨胀材料的体积大小，将不同体积的压迫材料植入大鼠颈部C5～7椎板和硬脊膜间，形成了轻型脊髓颈椎病、重型脊髓颈椎病的动物模型。本实验也同样受到了上述实验的启发，通过植入两种大小不同体积水凝胶材料，短期内制造出轻度、重度两种脊髓型颈椎病慢性压迫性模型，加入对大鼠的运动功能评价，并更深一步研究受压节段椎间盘中炎性因子的mRNA和蛋白的表达水平，探索脊髓型颈椎病慢性压迫的发病机理。术中通过直接的观察，发现脊髓后方脊膜上有毛细血管充血受压改变，脊髓压迫导致了脊髓缺血和静脉的阻塞[12]，引发了脊髓神经元细胞损伤，出现相应临床症状。当然本方法也有自身的缺点和不足，由于膨胀速度只能依靠材料本身特性，实验者难以人为控制其对颈髓的压迫速度和程度。因此，吸水性膨胀材料法制造脊髓型颈椎病的慢性压迫性动物模型，需要相关技术和材料的进步来对其进一步的完善和提高。

慢性脊髓损伤中神经元细胞的凋亡和脱髓鞘改变在脊髓功能下降过程中起到了非常重要的作用。戎利民等[13]通过对CSM患者的尸体解剖，发现在椎管狭窄脊髓受压节段有凋亡细胞的存在，并在颈椎管狭窄的小鼠模型病变节段脊髓中发现多种凋亡蛋白的高表达，参与并调节了脊髓受压部位的神经元细胞的损伤过程，说明了神经元细胞的凋亡机制在脊髓型颈椎病神经损伤的过程中起到了非常重要的作用。本实验通过对脊髓病理HE染色及细胞凋亡实验研究发现，对照组脊髓灰白质细胞形态正常，无损伤改变，术后随着压迫时间延长和压迫程度增加，神经元细胞和轴突空泡的变性，脱髓鞘逐渐加重，甚至出现神经元细胞坏死，凋亡细胞阳性数也在逐渐增加，与手术建模的时间成正相关，在统计学上有明显差异。通过以上实验结果表明，我们的CSM慢性压迫性模型与预想结果相符合。

大量的研究发现，椎间盘中炎性因子在椎间盘退变中起到了非常重要的作用[14-15]。我们通过PCR对椎管内受压节段椎间盘中的炎性因子进行测量，各组中随着压迫时间延长mRNA含量逐渐增加，而且植入水凝胶尺寸越大对脊髓压迫越重，mRNA含量越高，且两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot方法轻度、重度压迫模型组中随着压迫增加，压迫时间延长，各细胞炎性因子蛋白表达越高，说明脊髓受压越重，受压脊髓周围组织中炎性蛋白表达越高。而且相关炎性因子的表达与压迫时间之间也存在正相关，时间越长相关炎性因子表达越高。说明炎症因子表达与压迫程度关系密切，在脊髓型颈椎病发展过程中起到了非常重要的作用，也对我们的治疗有一定启示作用。