八珍补汁质量标准提升研究

姚世霞,王春瑶,朱旭江,胥顺堂

(1.甘肃省药品检验研究院,甘肃 兰州730070;2.甘肃岷县当归研究院,甘肃 定西748400;3.甘肃天水岐黄药业有限责任公司,甘肃 天水741000)

八珍补汁为党参、当归、川芎、甘草、白芍等八味药材经现代工艺制成的煎膏剂,处方来源于气血双补中药名方八珍汤,具有调补气血的功效[1]。现行标准为卫生部药品标准中药成方制剂第十四册,此标准仅有常规煎膏剂的检查项,缺少对药味的关键质控项目,急需进行标准的提升研究。在该处方中,当归-川芎是广为应用的补血、活血药对,其中当归能补血养血,川芎可行血散血,两药配伍可协同增强养血和血、活血袪瘀的功效[2]。阿魏酸为当归、川芎药材中均含有的一种小分子酚酸[3],具有抗炎、活血等多种作用[4-7],本研究选择阿魏酸为检测指标,建立了HPLC测定八珍补汁中阿魏酸含量的方法,同时对处方中的当归、川芎、白芍、甘草建立了TLC鉴别方法,提升了八珍补汁的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20A液相色谱仪;薄层自动成像仪(瑞士卡玛);电子天平(Mettler ME 204);KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

当归对照药材(批号:120927-201617),川芎对照药材(批号:120918-201612),甘草对照药材(批号:110723-201413),芍药苷对照品(批号:110736-201943,含量95.1%),甘草酸铵对照品(批号:110731-202021,含量96.2%),白芍对照药材(批号:120905-201610),阿魏酸对照品(批号:110773-201614,含量99.0%),均购于中检院;八珍补汁样品(批号分别为:180101、180102、181202、181203、181204,甘肃天水岐黄药业有限责任公司提供);硅胶G板(青岛海洋化工有限公司:20160322,阿拉丁公司:HX55160026);甲醇(色谱纯),其余试剂等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 当归、川芎的鉴别 取样品15 g,用15 m L石油醚(30~60℃)振摇提取2次,合并石油醚液,挥干溶剂,残渣加甲醇1m L使溶解,作为供试品溶液。取当归、川芎对照药材各0.5 g,同法制成相应的对照药材溶液。分别取处方中不含当归、川芎的其余药材,按处方工艺制备成阴性样品,取10g,同法制备,作为阴性对照溶液。用微量毛细管吸取以上溶液各10μL,点于同一硅胶G薄层板上,在正己烷-乙酸乙酯(9∶1)溶液中展开,置紫外光灯(365 nm)下检视。结果,样品在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的蓝色荧光斑点,阴性无干扰,见图1。

图1 当归、川芎的薄层鉴别色谱

2.1.2 甘草、白芍的鉴别 取本品15g,用30m L水饱和的正丁醇振摇提取3次,合并提取液,蒸干,残渣加乙醇1m L使溶解,作为供试品溶液。取甘草对照药材、白芍对照药材各1g,分别加水50m L,煎煮30 min,过滤,滤液照供试品制备方法同法制备,分别作为对照药材溶液。取芍药苷对照品,用乙醇制成1 mg/m L的溶液。分别取不含甘草和不含白芍的阴性样品,称取14 g,按照供试品溶液制备方法同法制备,作为缺甘草的阴性对照溶液和缺白芍的阴性对照溶液。微量毛细管吸收上述5种溶液各10μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,在乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)溶液中展开,以10%硫酸乙醇溶液显色,热风吹至斑点显色清晰。结果,样品色谱中,在与白芍、甘草对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性未见干扰。见图2。

图2 白芍、甘草的薄层鉴别色谱

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent HC-18 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为甲醇-4%冰醋酸(22∶78),柱温30℃,流速:1.0m L/min,进样量:10μL;检测波长为320 nm。

2.2.2 溶液的制备 精密称取本品10 g,置25 m L量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即为供试品溶液。称取阿魏酸对照品11.84 mg,加甲醇制成浓度为9.38μg/m L的对照品溶液。取处方中除去当归、川芎的其他药味,按照制法制备成阴性样品,取8 g,按照供试品溶液制备方法同法制备,即为阴性对照溶液。

2.2.3 系统适用性试验 取“2.2.2”项下制成的3种溶液各10μL,注入液相色谱仪,分别计算出理论塔板数>5 000,供试品溶液色谱中阿魏酸及相邻峰分离度>1.5,拖尾因子为1.02,满足系统适用性测定要求。

2.2.4 专属性试验 取“2.2.2”项下制成的3种溶液各10μL,按“2.2.1”项下条件测定。结果表明在上述液相色谱条件下,供试品色谱中阿魏酸的峰形对称,分离度>1.5,且阴性对照对测定无干扰。见图3。

图3 八珍补汁的HPLC色谱

2.2.5 精密度试验 取“2.2.1”项下制成的对照品溶液10μL,重复进样6次,6次峰面积的RSD为2.5%,显示方法的精密度符合要求。

2.2.6 重复性试验 取同一批样品(批号181204)6份,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样,计算6份含量的平均值为8.4μg/g,RSD为1.6%,表明重复性较好。

2.2.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液(批号181204),分别在0、4、8、12、16 h进样,结果供试品溶液在16h峰面积的RSD为0.8%,表明16h内稳定性良好。

2.2.8 线性范围考察 精密吸取“2.2.1”项下的对照品溶液2、5、10、15、20、25、40μL,注入液相色谱仪,测定峰面积积分值,以对照品溶液的进样量(X,μg)对峰面积积分值(Y)计算线性回归方程。线性回归方程为:Y=5.496 0×106X,r=1,表明阿魏酸在0.017 0~0.340 8 g范围内有良好的线性关系。

2.2.9 耐用性考察 取同一批号样品,在3个不同品牌的色谱柱(Agilent HC-18、月旭C18、Agilent TC-18)上测定,结果RSD为1.4%。采用不同的高效液相色谱仪(岛津LC-20A、Waters e2695、日立液相色谱仪)测定,结果RSD为2.1%,符合液相方法中对耐用性的要求。

2.2.10 回收率测定 取50m L量瓶9个,分为3组,每组3个,分别按样品含量的50%、100%、150%,精密加入一定量的对照品溶液,氮气吹干,然后再向瓶中精密加入样品,每份约5 g,按“2.2.2”项下供试品溶液同法制备,进样测定,结果平均回收率为99.7%,RSD为2.7%,见表1。

表1 回收率测定结果

2.2.11 样品测定 按照拟定的方法测定5批样品含量,结果见表2。

表2 含量测定结果

3 讨论

(1)通过建立2个TLC鉴别方法,有效鉴别出八珍补汁中的4种药味,操作简便,省时省力。建立的方法分别经过不同的温湿度、不同品牌硅胶板及不同点样的量的验证,弥补了现行标准鉴别的缺项。

(2)考察了3种流动相[甲醇-4%冰醋酸(22∶78)、甲醇-2%冰醋酸(25∶75)、乙腈-0.1%磷酸(17∶83)]和2种提取溶剂(甲醇、50%甲醇),结果3种流动相均能达到系统适用性要求,甲醇-4%冰醋酸(22∶78)为流动相时阿魏酸的峰形较好,分离度更高;以甲醇为溶剂时,样品中阿魏酸更高。因此以甲醇为提取溶剂、甲醇-4%冰醋酸(22∶78)作为测定用流动相。