ADRB2、GLCCI1、FCER2基因多态性与小儿哮喘治疗效果以及患儿肺功能的关系

李阳

（江苏省人民医院，江苏 南京，210029）

支气管哮喘是一种以反复发作的咳嗽、喘息、胸闷及呼吸困难为表现，儿童时期最常见的慢性气道高反应性疾病。全国儿科哮喘协作组曾先后进行过三次全国规模的儿童哮喘患病率调查，提示我国儿童哮喘的患病率呈显著上升趋势。哮喘的病因及发病机制极为复杂，涉及到遗传、特应性体质、环境、饮食、气道高反应性、性别、肥胖、药物等多个方面。哮喘不仅影响个人的生活质量，也给家庭及社会造成了沉重的精神和经济负担，亦消耗着巨大的医疗卫生资源[1]。

由于儿童哮喘的高发病率、高复发率、高危险性的特点，作为儿童呼吸科最常见的疾病，一直以来都是儿童医院呼吸领域研究的热点和难点[2]-[3]。虽然GINA 方案得到大力普及和推广，但由于个体遗传背景的差异，使得患儿对于β2 受体激动剂及ICS（吸入性糖皮质激素）的敏感度不同，治疗的效果以及远期肺功能变化情况也存在较大变异，因此，本研究旨在探讨哮喘患儿ADRB2、GLCCI1、FCER2 基因多态性与患儿哮喘治疗效果以及肺功能变化的关系，以期为提升此类患者的临床治疗效果提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2016年11月至2018年6月期间本院收治的哮喘患儿为研究对象，跟踪随访其治疗效果以及最新一次的肺功能检测结果，并按照相关定义分为不同的临床转归组。纳入标准：年龄0～16 岁；经本院呼吸内科确诊为“支气管哮喘”或“变异性哮喘”的患儿；所有患儿均为初次确诊，并未接受过相关治疗；患儿监护人同意参与本研究，并签署了知情同意书者。排除标准：既往接受过哮喘相关治疗的患儿；合并有其他严重呼吸系统疾病的患儿；患有严重的感染性疾病或运动系统疾病，不能耐受激素治疗的患儿；监护人拒绝参与研究的。

1.2 方法治疗效果的定义，所有患儿均根据其临床状况采用ICS 与β2 受体激动剂联用的治疗方案，按照患儿治疗后的临床转归定义为治疗效果好与治疗效果一般，治疗效果好指哮喘症状部分或全部控制，在临床医师的指导下减药或停药的患者；治疗效果一般指哮喘症状未得到有效控制，或调整药量后出现反复的患者。

肺功能检测定义，按照患儿最近一次肺功能检测的结果进行分组，肺功能无异常或气道功能改善的患者为肺功能正常组，存在气道改变或舒张试验阳性的患者定义为肺功能异常。生物样本的采集与测定：用荧光染色原位杂交技术对GLCCI1、ADRB2、FCER2 进行基因分型，抽取患儿2ml 静脉血，从血液样本提取核酸：将待检血液标本颠倒混匀数次；10× 红细胞裂解液（氯化铵）与灭菌水按1∶9 比例稀释到工作液（1× 红细胞裂解液）浓度；取1.5ml 离心管，加入1.2ml 红细胞裂解液（工作液），取200μl 待检标本加入离心管中，上下颠倒混匀，室温静置5min；将离心管放入离心机中，离心5min，转速：3000r/min；或700× g 离心完成后取出离心管，用枪头吸去上清，保留沉淀；紧贴管壁，缓慢加入适量0.9%氯化钠溶液（约500～1000μl），清洗管壁和白细胞表面（注意不要将白细胞吹起），弃上清。（如白细胞红色较重可直接加入1000μl 的0.9%氯化钠溶液，混匀，离心5min，转速：3000r/min；或700× g，弃上清）；加入50～100μl 耀金保，混匀，室温静置30min。取1.5μl 最后一步的混合液加入到1 支耀金分中，充分混匀；组织蜡片直接加入耀金分中，用移液枪头捣碎，并至液面下，将混匀后的样本顺序放入检测仪器中，关闭仪器封盖。对仪器进行相应设置，运行仪器，进行检测。

SNP 的选取原则依据下述原则挑选本研究所需的SNP：①确认有效状态（确认该SNP 在中国群体中被有效证明）；②杂合度，要求最小等位基因频率（minorallelefrequencies，MAF）＞0.1，一个SNP 的两个等位基因的出现频率越高，获得杂合子越容易，从而可以确保较高的杂合性，提高统计功效；③既往研究中证明了该SNP 在哮喘治疗中效果影响的有效性；④在多个来源的SNP 数据库中有报道。

1.3 数据收集与分析本研究中研究对象的一般信息以及目的基因的检测信息收集完成后由两位数据录入人员使用Epidata3.0 进行双录入建立数据库，在分析之前使用SHEsis 软件对各S NP 进行Hardy-Weinbergequilibrium（HWE）检验，使用SAS9.4 构建不同的遗传模型，并检验在各模型下各SNP 基因多态性在不同组间患者内分布的差异,使用logistic 回归模型校正年龄、性别、病程等因素的影响，本研究的检验水准统一设置为0.05。

2 结果

2.1 研究对象的一般特征情况83 例研究对象中，男52 例（62.65%）；所有研究对象中，年龄3～16 岁，平均年龄（10.64± 2.89）岁。其中被诊断为支气管哮喘者10 人，诊断为咳嗽变异性哮喘者73 人；病程＜2年的有19 例（22.89%），病程在2～5年的有51 例（61.44%），病程＞5年的有13 例（15.66%），见表1。

表1 83 例研究对象的一般特征

2.2 目标SNP 信息以国家基因数据库CNGB 为数据源，依据SNP的挑选原则挑选目标SNP，最终纳入3 个目标SNP 为研究对象（ADRB2 基因的rs1042713 位点，GLCCI1 的rs37973 位点，FCER2的rs28364072 位点），三个位点的基因信息经Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果显示，差异均无统计学意义；rs1042713 位点的应答率为95.8%，rs37973、rs28364072 两位点的应答率均为100%，各SNP 的信息，见表2。

表2 目标SNP 信息

2.3 药物受体基因多态性与患儿治疗效果的关系按照患儿的治疗转归分组后，比较不同治疗结局间各SNP 基因型的分布差异，结果显示，对于ADRB2 基因型的rs1042713 位点，在各遗传模型下基因型的分布差异均无统计学意义；对于GLCCI1 基因的rs37973 位点，在加性模型以及显性模型下，基因型的分布差异有统计学意义（P＜0.05）,显性模型下的结果显示，GG 基因型的患儿发生治疗结果不良的风险是GA 以及AA 基因型患儿的18.20 倍（95%CI：4.92～67.26）；对于FCER2 基因的rs28364072 位点，加性模型与隐性模型下差异均有统计学意义，见表3。

表3 各SNP 与哮喘患儿治疗效果的关系

2.4 药物应答基因与患者肺功能的关系在不同遗传模型下对各基因目标SNP 基因型在肺功能正常与异常患者间分布差异的检测结果显示，对于ADRB2，在隐性模型下，目标SNP 基因型在不同肺功能检测结果患者间分布差异具有统计学意义，GG 基因型的患者发生肺功能异常的风险仅为GA 与AA 基因型的0.32倍（95%CI：0.12～0.87），对于GLCCI1，目标SNP 各基因型在不同遗传模型下与不同肺功能检测结果患者间分布差异无统计学意义。对于FCER2，在加性模型、显性模型下目标SNP 的各基因型在不同肺功能检测结果的患者间分布差异具有统计学意义，见表4。

表4 各基因目标SNP 基因型与患者肺功能变化的关系

3 讨论

本研究的目的旨在从遗传机制以及分子层面探讨影响小儿哮喘治疗效果的因素，以期加深对于此类疾病治疗分子机制的理解，从而提升临床治疗效果。结果显示，ADRB2、GLCCI1、FCER2 三个基因的多态性均与小儿哮喘治疗效果或患儿临床肺功能转归相关[4]-[5]。

既往研究证明[6]-[7]，ADRB2 基因的表达及功能可影响以β 2-肾上腺素受体为作用靶点的支气管扩张剂（包括β受体激动剂、茶碱类、抗胆碱类药物等）的药物效应，因此，其多态性可能作为影响因素对使用β2 肾上腺素受体激动剂作为哮喘治疗手段的患儿长期预后造成影响，本研究结果显示，对于ADRB2基因rs1042713 位点基因型为GG 的患儿，GA 以及AA 基因型的患儿发生肺功能异常的风险更高，与Lipworth，Zuurhout 等在国外成年哮喘患者中所得的研究结论相一致。此外，本课题组在同样遗传背景的患儿中进行的前期研究中也发现在难治性哮喘患儿中，ADRB2AA 型者，停用β2 受体激动剂，给予噻托溴铵后，患儿哮喘得到明显控制，提示此基因作为小儿哮喘个体化治疗依据的意义。

糖皮质激素诱导的转录基因1（glucocorticoid-inducedtranscript1gene，GLCCI1）位于人类染色体组的7 号染色体上，其编码一种功能尚不清楚但由糖皮质激素诱导表达的蛋白。既往研究的结果显示，此种蛋白质可能是糖皮质激素诱导的细胞凋亡的早期标志物，因此其表达水平可以影响到糖皮质激素生理作用的大小，两项关于糖皮质激素诱导转录基因多态性研究发现，rs37973 位点G 等位基因与治疗反应较差有关。与本研究的结果相互印证[8]-[9]。此外邱玉明等在中国汉族人群中的研究结果也证实了GLCCI1 基因多态性对于糖皮质激素吸入治疗哮喘疗效的影响。

FCER2 位于人类染色体组第19 号染色体上，是一种蛋白编码基因，其在调控IgE 生成中起着重要作用，是过敏性哮喘的重要介导因子。既往研究的结果证实，FCER2 基因rs28364072位点的多态性为与哮喘的严重程度、住院风险，住院时间有关。推测可能是由于在使用糖皮质激素吸入疗法治疗哮喘时，FCER2基因突变的患者可通过提高IgE 表达水平加重气道功能的异常，从而加剧不良反应的程度[10]。本研究结果显示，相较于FCER2基因rs28364072 位点为GA 或AA 的患者，GG 基因型的患者发生肺功能异常的风险更高，与Tantisira 等在国外哮喘患儿中进行的研究结果一致，此外，Rogers 等的研究结果显示，同一位点GG 基因型的患者，接受糖皮质激素吸入治疗时肺功能（FEV1%）恶化的相对危险度（OR）为2.1，与本研究的结果相互印证。

既往关于哮喘的研究提示，此疾病为受基因与环境共同影响的多基因遗传病，多种基因通过不同通路共同作用与哮喘的发病以及后续对治疗的反应，因此患者的治疗效果变异较大，近些年来越来越多的证据提示基因诊断在哮喘治疗中的价值，几位专家[11]-[12]应用ADRB2、GLCCI1、FCER2 三个基因多态性检测有效提升了两例小儿难治性哮喘中的治疗效果，并且成功的降底了并发症的发生风险，与本研究的结果一致。

综上所述，本研究的结果显示，GLCCI1 基因的rs1042713位点、FCER2 基因多态性与哮喘患儿药物治疗效果相关，ADRB2、FCER2 基因多态性与哮喘患儿肺功能转归有关。提示了此三个基因多态性检测结果在指导哮喘临床用药中的意义。