基于网络药理学探究补髓丹治疗骨质疏松的作用机制

孙海超 于洪杰 陈德强

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种以骨小梁数量减少、骨质密度降低、骨组织微结构破坏和骨脆性增加为主要特征的全身性骨骼疾病[1]，成骨细胞促进骨的形成与重建作用同破骨细胞促进骨的修复与重建作用之间的失衡是其主要的病理因素。美国NIH将OP定义为以骨强度下降和骨折风险增加为特征的骨骼疾病, 指出骨量降低是OP发生的主要因素，同时也存在其他因素增加患病风险。

各年龄段骨质疏松性骨折的发病率都在增加，但更多见于绝经后女性和老年人。随着社会的发展，中国已经进入老龄化社会，本病的发病率在持续升高，据不完全统计，2020年中国老龄化比例在17.7%左右，大大超出国际标准的10%，而因老年人肝肾亏虚，常患有OP，骨质疏松导致骨脆性增加大大限制了老年人的日常生活，骨脆性的增加同时会导致骨折的频发，严重影响生活质量[2]。因此，在我国OP的预防与治疗就显得极为重要。临床上OP主要以双膦酸盐类作为一线治疗药物，其次是核转录因子-κB受体活化因子配体(RANKL)抑制剂[3]。中医学虽未有骨质疏松这一名词，但类似于骨质疏松症状的记载则可追溯至《黄帝内经》时期，并散见于历代名家所著医案中，如对“痹证”“骨伤” “痿病”等病证的记载。中医学目前认为OP的发生主要与肾、脾、肝的功能密切相关，肝肾亏虚和脾虚等是发病的重要原因[4]。

补髓丹最早记载见于《是斋百一选方》，原文描述补髓丹如下：升神水于百会，降神火于涌泉，还淳返朴，体合自然，骨正筋柔，益寿延年。体现补髓丹补髓生精、和血顺气的作用，主治老年肾虚，腰痛，臂痛，久痨愈后，髓干精竭，血枯气少，疲惫未复。因此本人认为补髓丹在治疗肝脾肾亏虚所致的骨质疏松方面有较好的预期作用，但中药复方有着多成分、多靶点、药物之间存在复杂的协同作用等特点，导致其具体作用机制尚不明确，本次研究借助网络药理学将药物靶点网络与生物信息网络相结合，探讨补髓丹治疗OP的分子机制，为补髓丹后续探究以及临床应用提供指导。

1 资料与方法

1.1 补髓丹的成分收集本次研究依托中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[5]检索补髓丹组成(补骨脂、杜仲、鹿茸、没药)的全部化学成分。

1.2 活性化合物及靶标蛋白的筛选中药在人体内会通过吸收、分布、代谢、排泄(ADME)的过程最终达到靶标器官及组织发挥其相应作用，根据药代动力学提供的标准，在TCMSP中选择吸收、分布、代谢、排泄方面的药物相似度(Druglikeness，DL)和口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)作为筛选标准，选择同时满足DL≥0.18和OB≥30%条件的成分并下载其mol格式的2D结构和经典化学结构(SMILE结构)以用于靶点预测。将收集到的相关活性成分使用蛋白质资源数据库Uniprot(http://www.uniprot.org)[6]确认预测的目标信息，得出补髓丹全部已知靶点。

将上述下载的MOL结构输入PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[7]中，该平台会自动根据输入的MOL结构相似度匹配预测靶点并发送到预先输入的邮箱，筛选后可获得补髓丹全部预测靶点。

1.3 补髓丹化合物-靶点网络的构建目前得到的补髓丹化合物及其对应目标之间均为零散状态，为在系统水平上了解其相互之间复杂的关系，可利用Cytoscape 3.2.1软件(http://cytoscape.org/)构建化合物-靶点网络。

1.4 疾病靶点的筛选通过人类孟德尔遗传综合数据库OMIM(https://omim.org/)[8、治疗靶标数据库TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[9]、人类基因数据库GeneCards(https://www.genecards.org/)[10]、综合型药物数据库Drugbank(https://go.drugbank.com/)[11]和疾病基因数据库Disgenet(https://www.disgenet.org/)[12]，以Osteoporosis(骨质疏松)为关键词搜索已知疾病靶点，利用uniprot数据库对获得的疾病相关靶点信息进行验证筛选及补充。

1.5 蛋白质相互作用网络(PPI)的构建及其核心网络的筛选利用Cytoscape 3.2.1中插件功能导入已整理的补髓丹全部靶点和骨质疏松全部靶点，对两网络取交集,利用LAC、DC、Degree、Betweenness、Closeness等值对交集进行筛选，最终得出核心网络。并利用Cytoscape 3.2.1对网络进行可视化分析，并进行插件网络分析，分析网络拓扑特性。

1.6 核心靶点的通路分析为了深入了解上述核心靶点通过何种通路以及生物过程和分子功能对预防和治疗骨质疏松起作用，将核心靶点导入Metascape(https://metascape.org/)[13]数据库分别进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GO(Gene Ontology)分析，选择物种为人类(Homo Sapiens)，阈值为P<0.05，并对富集分析结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选通过TCMSP平台可检索到杜仲147个、没药276个化合物信息，补骨脂以及鹿茸的相关成分在TCMSP中尚未收录，因此采用BATMAN-TCM(a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)平台[14]对其相关成分进行检索，设置Score cutoff为20，P≥0.05为标准进行筛选，得出补骨脂14个、鹿茸15个化合物信息，将其返回TCMSP平台搜索以保持与杜仲和没药相关化合物成分的数据一致性，根据设置的筛选条件(OB≥30%， DL≥0.18)进行筛选，最终获得补骨脂3个、鹿茸2个、没药29个、杜仲23个，共计57个化合物，其中3个化合物为共有化合物。见表1。

表1 共有化合物一览表

2.2 化合物靶点筛选及PPI网络构建上述总计54个化合物在TCMSP中Target选项卡中可查询其已知靶点，取已验证靶点，其中杜仲221个、补骨脂46个、没药198个、鹿茸28个。为保证数据的准确性，同时在PharmMapper网站基于MOL结构对上述4种主要成分进行靶点预测，以Norm Fit≥0.85且靶点信息已验证为标准进行筛选，获得杜仲125个、补骨脂43个、没药108个、鹿茸24个。对以上靶点分类合并且在Excel中进行去重，最终获得杜仲294个、补骨脂72个、没药268个、鹿茸48个靶点，为了在系统层面上了解各成分之间的相互作用，将上述数据重新整理，构建network及type文件导入Cytoscape 3.2.1中进行PPI网络构建并进行优化。见图1。

图1 复方成分-靶点网络图

2.3 骨质疏松靶点筛选分别从OMIM、TTD、GeneCards、Drugbank和Disgenet数据库中以Osteoporosis(骨质疏松)为关键词获取相关骨质疏松靶点，舍弃未验证靶点并去重后得到2480个骨质疏松相关靶点，对上述靶点进行Uniprot编码转换，其中未被Uniprot收录的靶点有214个，舍弃这部分未收录靶点后得到骨质疏松相关靶点共计2266个。

2.4 骨质疏松与补髓丹的靶点交集利用Cytoscape 3.2.1中插件功能BisoGenet-Create a new network新建网络并分别导入已整理的补髓丹全部靶点和骨质疏松全部靶点，在弹出对话框中 Identifiers选项卡均选择基因型为人类基因型(Homo sapiens)，映射对象为仅基因标识符(Gene identifiers only)，Data Settings选项卡中仅选择蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction)。最后点击确定，系统自动根据导入数据分别生成补髓丹全部靶点网络和骨质疏松全部靶点网络。对自动生成的两网络进行非矢量网络分析(Analyze Network)后利用Merge-Network中取交集的功能对两网络取交集，获得交集网络共5002个节点，133268条相互关系。

2.5 补髓丹与骨质疏松蛋白质相互作用网络的构建与筛选利用插件功能CytoNCA分析交集网络的相关属性，利用Degree值中位数的2倍为初始条件筛选出初步核心网络，用LAC、DC、Degree、Betweenness、Closeness等值进一步筛选，最终得出核心网络，含有166个节点及2769条相互关系。见图2。利用Cytoscape 3.2.1对网络进行可视化分析，并进行插件网络分析，分析网络拓扑特性。可知EGFR、JUN、MAPK1、SRC、TP53、ESR1、TP53、EP300、HDAC1、UBC和AKT1等为关键节点。

图2 核心靶点筛选流程图

2.6 靶点通路分析利用MetaScape数据库对筛选出来的166个核心靶点分别进行GO和KEGG通路富集分析，其中GO分析过程应分别对GOCC(Cell component 细胞成分)、GOBP(Biological process 生物过程)以及GOMF(Molecular function分子功能)进行分析。KEGG分析得出关键通路为癌症通路，肿瘤转录失调，内分泌抵抗，甲状腺激素通路，胰岛素抵抗信号通路，MAPK信号通路， PI3K-Akt信号通路，凋亡信号通路等。GOBP分析得出蛋白质去泛素化，泛素依赖性蛋白分解过程，DNA结合转录因子活性的调节，对生长因子的反应。GOMF分析得出泛素蛋白连接酶结合，转录因子结合，转录调控空激酶结合，蛋白质结构域特异性结合GOCC分析得出核染色体，转移酶复合体，蛋白酶体复合体，蛋白质-DNA复合物。基于微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)将富集分析结果前20条制作成气泡图。见图3、图4。

图3 KEGG分析前20位气泡图

图4 GO分析前20位气泡图

3 讨论

根据复方-靶点PPI交互图可得没药和杜仲的共有成分β-谷甾醇和槲皮素以及补骨脂和没药的共有成分豆甾醇起到主要作用，查阅文献可知豆甾醇具有抗氧化，抗肿瘤，抗炎症，降低胆固醇以及镇痛的作用[15]，这些作用同时在抗骨质疏松方面起到重要作用；β-谷甾醇除具有与豆甾醇相似作用外，还具有更关键的调节骨代谢平衡的作用[16]，而骨质疏松的发病机制最重要的就是成骨细胞与破骨细胞之间的骨代谢平衡失调；槲皮素是一种黄酮类化合物,可有效促进MC3T3-E1细胞的成骨细胞分化[17],可抑制RAW264.7细胞中的破骨细胞生成。从调节骨代谢平衡方面骨小梁结构的数量显著增加,从而增强骨密度,预防骨质疏松[18]。

KEGG富集分析表明补髓丹主要成分治疗骨质疏松主要涉及的通路有癌症信号通路，胰岛素信号通路，内分泌抵抗信号通路，肿瘤转录失调信号通路，凋亡信号通路，MAPK信号通路和 PI3K-Akt信号通路等多条通路。核心靶点中的TP53存在于凋亡通路中，主要作用为调控细胞周期和细胞分裂。MAPK1是MAPK的一个亚型，是MAPK信号通路的重要组成部分，许多胞外信号通过MAPK信号通路，参与成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化和凋亡，在骨质疏松的发生中具有重要作用[19]而AKT1 则是 P13K/Akt 信号通路的重要组成部分，AKT1可在多种组织中表达，参与调节细胞的生长和增殖，有研究显示，增强AKT 的激酶活性，可调节葡萄糖转运蛋白 4(Glucose Transporter 4，GLUT4)的表达和转位，促进骨骼肌细胞对糖的消耗，这可能是促进机体糖代谢的重要过程。而葡萄糖可直接刺激破骨细胞的活性，促使骨量丢失[20]。同时TP53,MAPK,ESR1与AKT1均存在于内分泌抵抗信号通路、癌症信号通路和肿瘤转录失调信号通路等多条与癌症相关的通路，通过调控细胞生长分化分裂与凋亡，抑制癌症基因的表达从而与骨质疏松的发病密切相关[21]，同时内分泌抵抗信号通路和胰岛素信号通路还参与糖尿病并发症的发生。有研究[22]表明，大约有23%的男性和18%的女性因骨质疏松而导致非椎体骨折，而此比例在代谢综合征患者中尤甚。目前已知肥胖、高血脂、高血糖和高血压病等代谢异常状态是与OP发生密切相关的因素[23]，因此糖尿病并发症的通路也参与骨质疏松的发病。而从Go富集分析中则可以看出补髓丹主要成分治疗骨质疏松主要可能与凋亡信号通路，转录调控，转录激活因子，蛋白质去泛素化，泛素依赖性蛋白分解过程，泛素蛋白连接酶以及核染色体，转移酶复合体，蛋白酶复合体等相关，提示补髓丹可能通过以上相关作用预防和治疗骨质疏松。

综上所述，补髓丹的有效成分通过多个途径参与成骨与破骨过程，并且通过部分代谢通路参与骨质疏松的发病。体现了补髓丹治疗骨质疏松多成分、多靶点、整体作用参与骨质疏松进程，同时也警惕了我们某些发病不仅与疾病本身相关，代谢类疾病仍是我们需要关注的重点。本研究目前仅从网络药理学方面初步探究补髓丹预防与治疗骨质疏松的成分-靶点网络途径，从生物信息学方面阐述了补髓丹的作用机制，为后续临床研究提供了理论支持。