林木植原体病害传播及PCR检测研究进展

刘文汝，甄志先,2

(1 河北农业大学 林学院，河北 保定 071001； 2 河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000)

近年国内部分地区在进行林木种植及育种工作时，为追求育林速度及短期效益，常进行单一或少量几种树种的种植及研究，结果造成林木树种组成结构简单，品种固化，遗传基础减小，林木病虫害感染风险增加。而目前国内林木病害研究多集中于细菌、真菌、病毒性病害，对于其他类型的病害则关注较少。

植原体病害，病原为植原体(Candidatusphytoplasma)，原名类菌原体(MLO)，分类上隶属于细菌界，软菌纲，是一类定殖于植物韧皮部的侵染性病害，广泛发生于世界各地。因传播特性、传播方式与病毒类似，常造成多种植物间的交叉感染，因而传播规律较难掌握。近年该病害在园林绿化及苗木繁育中多有发生，常导致植物体内激素代谢紊乱，进而发生叶片小叶、黄化、萎蔫、皱缩[1]和枝条丛生、带化[2]等症状，据报道该类病害已危害1 000多种植物，我国发现已达100多种[3]。不但可危害粮食、棉花、油料、花卉、药材、蔬菜等许多粮食作物、经济作物，同时还危害果树、橡胶、桑、竹、银杏等林木和珍贵树种，对人类经济、生活均有重大影响。其中，枣疯病[4]和泡桐丛枝病[5]危害日益严重，如新郑和濮阳的2处放任枣园，发病率分别达到了76%和50%，发病指数分别达到了107和57程度[6]。不仅极大地影响了树木的正常生长，而且使得林木在园林绿化中的美观性以及经济效益显著降低。但因植原体为无细胞壁原核生物，粒子直径为800～1 000 nm，形态因对外界压力敏感，呈现多变性[7]，且培养条件极其苛刻[8]，对其进行传播规律及检测研究较为困难，常规方法检测鉴定该类病害难度较大且准确性较低。近些年随着分子技术的逐渐成熟，利用分子技术去准确检测鉴定植原体类病害及发病程度成为该类病害研究的主要技术手段。

通过综合阐述近年林木植原体病害传播侵染特性和所采取的分子检测技术，综述讨论其进展成果，并展望其面临主要问题及未来发展趋势，以期为相关林木植原体病害的快速检测和防控研究提供理论参考。

1 林木植原体病害传播特点

1.1 林木植原体病害的流行

植原体的寄生部位为植物韧皮部的筛管部分，在传播侵染成功后，会使得植物体的整个养分输导系统均有可能携带植原体病菌。而植物体的某些寄生于韧皮部组织的外部寄生者，如刺吸类害虫、菟丝子等，从而间接充当植原体的外部自然传播媒介，尤其当这些传播媒介具有比较广泛的寄主范围时，极有可能造成一定范围内植原体病害的流行。

植原体的寄主范围较广，裸子植物、单子叶植物以及双子叶植物均可被其侵染[9]。王洁等[5]通过对泡桐丛枝病源附近的16种植物进行调查以及植原体分子检测鉴定，发现其中7种植物为植原体所侵染，并且推测这7种植物可能被泡桐丛枝植原体的自然寄主。尽管在某些林木植原体病源附近可能会发现该类植原体的自然寄主，但相关研究表明一种植原体群体内的 16SrDNA 序列往往并不一致，多样性较丰富[10]。Padovan等[11]报道通过 PCR-RFLP技术对番木瓜植原体病源附近作物和杂草进行检测发现，植原体的RFLP 类型株系高达6种，其中，2个优势类型高达总比例的 94%，这说明植原体可以通过某些昆虫或其他寄生生物实现林木与其周围植物间的交叉感染，并且植原体可能会随侵染寄主的改变从而产生某些菌株变化或基因型的改变。据顾沛雯等[12]研究结果表明小麦蓝矮植原体病害在其外部传播媒介昆虫的介导下，同时具有初侵染源、越夏寄主和过渡寄主等多个侵染源，而与小麦等草本植物相比，林木作为木本植物可能具有较长的生长年限，寄生于林木的植原体可能并不存在越冬、越夏等过渡寄主，但因其传播媒介特性，如某些昆虫的杂食性或以林下杂草作为产卵或幼虫的过渡寄主，这些寄主可能成为林木植原体病害的间接寄主。

1.2 人为因素介导的林木植原体病害传播

植原体的人为传播特点与病毒类似，其可以在较短时间内随植物汁液通过植物伤口进行传播，林木在人为管控过程中需要嫁接、修剪等处理，因修剪工具未及时进行消毒处理，会造成植原体大规模人为传播。但影响最大的人为传播方式主要是繁殖材料带有植原体病菌，植原体可以通过无性繁殖手段进行传播，包括嫁接、扦插等[13]。葛泉卿[14]研究结果表明修剪下的外表正常的葡萄藤在嫁接后可以传播葡萄植原体黄化病，但是并不是从染病植株上剪下的枝条均会传播植原体，这种结果证明植原体在寄主植物内部的分布并不均匀。而且植原体在侵染之后，寄主显现危害症状可能对侵染的植原体浓度有最低限度要求，Rafeket等[15]发现葡萄在受植原体侵染后，从看似正常无症状的枝条内可以检测到病菌的存在，因而这种情况下在挑选其作为繁殖材料时极易造成植原体的人为传播，Caudwell(1994)等[16]已经证实若干砧木品种已成为植原体黄化病的主要传播宿主。另一方面，基于林木植原体病害可以通过嫁接传播的特性，嫁接侵染已经成为检测繁殖材料健康及鉴定该类病害的主要手段，穆雪等[17]研究结果表明将带有植原体病害症状的樱桃接穗嫁接到健树上，健树在2 d后表现有植原体病害症状。

1.3 自然媒介介导的林木植原体病害传播

植原体的自然媒介传播方式是导致其大规模侵染及反复发病的主要原因。自然传播媒介大致可分为两类，一类是主要寄生于植物韧皮部的刺吸类昆虫，另一类为寄生植物，如菟丝子。据报道，植原体细胞表面具有一种主要的抗原性蛋白，并且最近被证明与昆虫肠道肌肉的微丝复合体相互作用。这种蛋白质被认为对传播和感染都很重要[18-19]，这说明植原体在长期的侵染过程中已进化成与传播宿主昆虫之间的高度互作。有研究表明葡萄枝条在被AY 植原体侵染后，其枝条颜色可能发生改变，从而具备发挥引诱Mgenia fuscovaria 成虫的功能[20]。刺吸类昆虫在取食含有植原体病菌的植物汁液后，植原体颗粒通过一段时间的“潜伏期”，会寄生于昆虫的唾液腺组织，但在感染其他植物之前，唾液腺内的植原体一般会繁殖到能够感染健康植物的剂量[21]，并在昆虫取食其他植物时，通过分泌唾液转寄于寄主植物[22]。植原体的昆虫传播媒介主要为叶蝉科、褐飞虱科和木虱科昆虫[13]，目前已经证实木虱可以传播多种果树植原体病害，包括欧洲坚果黄化病、苹果丛枝病和梨树衰退病等病害[23]。近年关于菟丝子传播植原体病害的相关研究较少，有研究表明菟丝子主要通过其在健康植株与病株之间所建立的“养分输导系统”进行植原体病害的传播，因而一些实验室借助于菟丝子进行植原体病害的研究，如Jaroslava等[24]利用菟丝子进行红醋栗到长春花之间的植原体传播研究。

2 PCR技术在林木植原体病害中的应用

2.1 林木植原体的通用引物设计

在经过上亿年的漫长进化后，细菌rRNA在核苷酸序列、碱基组成以及高级结构及生物功能等方面均表明其具有高度保守性，并进而能够反映细菌之间的亲缘关系[24]，在进行细菌分类时广泛应用编码其核酸染色体的基因片段16SrDNA进行菌群区分、分子鉴定，其长度约为1 500 bp，长度适中，另外序列中具有10个可变区并相间分布有11个恒定区，因而保守序列较多，且研究表明其可变区与细菌系统发育关系密切。因而众多研究工作者根据这一特性，利用16SrDNA进行细菌通用引物的设计[25-27]，其既可以高度特异扩增出含有16SrDNA的细菌，同时又可以利用细菌系统发育中所产生的16SrDNA可变区差异进行细菌不同种类的划分[28]。植原体，分类地位所属细菌界，在对其进行分子检测时也往往根据16SrDNA设计通用引物，因而在进行植原体病菌检测时往往需要根据病菌特性进行通用引物的筛选与选择，李横虹等[29]在进行樱桃带化病分子检测以及王洁等[30]在进行柿树带化病分子检测时均选用植原体通用引物R16MF2(5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′)/R16MR1(5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′)以及巢式引物R16F2(5′-ACGACTGCTAAGACTGG-3′)/R16R2(5′GCGG GTGTACAAACCCCG-3')进行病菌鉴定，而在进行杏黄化病[31]分子检测时以及在进行石榴带化病[32]病原检测时均选用直接引物P1(5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA TT-3′)/P7(5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′)和巢式引物R16F2n(5′-GAAACGACTGCT AAGACTGG-3′)/R16R2(5′-TGACGGGCGG TGTGTACAAACCCCG-3′)进行病菌鉴定。最近在进行Ziziphus oenoplia丛枝病[33]分子检测时，选用的巢氏引物为P1(5′-AAGAGTTTGATCC TGGCTCAGGATT-3′)/P7(5′-CGTCCTTCAT CGGCTCTT-3′)和3Far(5′-ACCTGCCTTTAAGACGAGGA-3′)/3Rev(5′-AAAGGAGGTG ATCCATCCCCACCT-3′)，虽然相关文献并没有提到选用植原体通用引物的具体原因，这可能与植原体序列16SrDNA的长短有较大关系。

2.2 PCR检测扩增的基因

rp基因为核糖体蛋白基因，其序列保守性与16SrDNA相似，但存在可变区更大，因而在进行植原体鉴定时挖掘出系统发育的标记以及更多有用信息，有利于进行植原体检测鉴定时一些亲缘关系较近而无法区分的植原体株系研究[34-35]。tuf基因广泛存在于细菌内部，其生理功能为生物蛋白合成中负责肽链的延伸，其保守性同上述2类基因类似，但同样具有较强的可变性，因而与rp基因一致，更加适合研究亲缘关系较近的植原体亚组间分类鉴定、系统发育研究[36]。因此，基于上述2类基因特性，在进行林木带化病及植原体类病害分子检测研究时，往往在进行16SrDNA基因序列分析的同时结合rp或tuf基因进行克隆、分子检测以及生物信息分析，这样既能避免16SrDNA基因分子检测出现的假阳性问题，也能够为带化病原鉴定提供证据支撑，如在进行国槐带化病[6]、竹柏扁枝病病原[37]以及枣疯病[38]等林木植原体类病害分子检测时均借助这种方法确定病原且进而确定其系统分类地位。

2.3 PCR检测方法的种类

2.3.1 直接PCR PCR技术通过体外获得植物DNA片段，进而通过相应引物设计以及快速循环扩增，可以有效且准确分离获得病原菌核酸产物，因而广泛用于不可体外培养进行形态及其他组织学观察鉴别的病原菌、病害的分离鉴定。林木带化病作为植原体类病害，在Deng等[39]首次通过PCR技术检测鉴定翠菊黄化病植原体后，PCR扩增技术被广泛用于林木带化病病原检测。近年，Nawres Al-Kuwaiti等人通过直接PCR的方法应用引物 ‘P1/P7’成功检测到沙橄榄丛枝病、豇豆带化病病原[40]，但Berges等[41]研究发现表现带化症状的组织与明显丛枝症状的植物组织相比，病菌浓度相对较低，同时据Lee等[42]研究，由于植物体总DNA浓度以及植物体内酚、蛋白等抑制物质影响，直接PCR技术往往易产生假阴性，王洁等[30]在进行柿树带化病分子检测时，通过直接PCR手段并未扩增出病原特异条带。

2.3.2 巢式PCR 巢式PCR技术是在直接PCR技术基础上衍生出的一种灵敏度以及特异性更高的一种PCR技术[43]，由于林木带化病组织中病原菌浓度相对较低，据刘秉胜等[44]的研究，植物体不同器官中的植原体病菌浓度随季节时间的变化具有较大差异，且感病组织中植原体浓度会随温度升高而逐渐增多，因而受季节温差变化影响较大[45]，而常规直接PCR在症状表现轻微或病菌浓度较低时应用结果常呈现假阴性，且据研究巢式PCR灵敏度比直接PCR高出至少1 000倍[46]，因而目前巢式PCR非常适合林木带化病及相关植原体类病害病原检测。它是通过采取第1次直接PCR所得产物进行一定程度稀释，而后直接作为第2次PCR模板，并采取不同引物进行再次扩增的一种PCR技术，有时可能根据病菌特性或者PCR结果进行3次、4次或多次PCR。目前国内外最新发现并报道的林木植原体病害均是主要依靠该方法进行检测鉴定：如杏黄化病[31]、桃丛枝病[47]、石榴带化病[32]、酸角黄化病[48]等。

2.3.3 实时荧光PCR 近些年，实时荧光PCR技术也逐渐应用于植原体类病害病原检测，因其封闭性以及与巢式PCR相当的灵敏性，使其能够完全应用于林木带化病害病原检测的同时，避免产生巢式PCR中出现的假阳性问题。由研究者设计并以能成功运用的光谱荧光探针，经试验不仅可以快速检测植原体，同时可以进行植原体与细菌间的区分，特异性较高[49]。因而可能更适合林木带化病害的病原检测，张甜甜等[50]通过对泡桐丛枝、枣疯、白蜡木黄化、苹果丛枝和榆树黄化等12种植原体病害进行基于TaqMan 探针的实时荧光PCR检测，并同时以健康植株作为对照，结果表明检测的所有植原体材料均获得较高的荧光信号并具有较高的特异性。另外，实时荧光PCR技术具有准确、定量检测的特点，所以根据这一特性，相关研究近年多应用其进行寄主不同部位的病原浓度检测。任争光等[51]通过检测不同抗枣疯病枣树接穗中的植原体浓度，成功建立枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测体系，其结果表明枣疯病寄主的发病严重程度与其内部的植原体浓度成正相关。

3 高通量测序

高通量测序是同时对几十到几百万条DNA分子进行测序，并且可以对转录组及基因组同时进行分析。因此，在对带病植物组织进行高通量测序时，不仅可以快速准确反映带病组织内部病原信息[52]，同时还可以反映植物组织内部生理状态，从而获悉其致病机理以及组织内部微生物群落相互关系，确定生防菌。自病毒病害中首次应用高通量测序技术获得成功以来，该项技术在未知病源物研究方面展现了巨大的优势[53]，因而近年相关研究通过利用该项技术针对一些未鉴定的植原体病害进行分析鉴定和致病机理研究，Mardi等[54]通过对酸橙植原体病害进行高通量测序研究，不仅对植原体的基因表达进行了鉴定分析，同时确定出差异基因上调和下调的主要富集代谢通路，对于该类病害的深入研究和验证提供了理论依据。另外，由于病毒类病害和植原体病害传播方式、致病特点比较相似，所以常导致某些研究相对较少的植原体病害病原与病毒的混淆，而通过高通量测序手段则可以针对其进行病原鉴定，例如张驰等[55]就通过高通量测序技术成功鉴定出慈姑黄化病的侵染病原主要为植原体，但目前因其花费较大，可能并未在林木植原体病害研究中普及。

4 展望

随着分子检测技术的不断发展，林木带化病病原分子检测、鉴定工作也逐渐向快速、灵敏、准确这一目标转变，如国槐带化病由起初仅仅确定病原为类菌原体(MLO)[56]，到如今确定分类地位为翠菊黄花组植原体[6]。综上所述，目前林木植原体病害病原分子检测主要应用基于16SrDNA基因的巢式PCR技术，虽其灵敏度较高，但因其操作过程的开放性极易造成痕量污染，从而出现假阳性结果。此外由于林木植原体病害在目前林业研究中并未引起足够重视，进而造成诸如免疫捕捉PCR技术、竞争PCR技术、基因芯片、多重PCR技术及高通量测序等在某些植原体病害以及病毒、真菌类病害中已相对比较成熟的分子检测手段未能引入相关林木植原体病害内进行应用，例如现在比较流行的带化病，虽然目前已有部分地区进行如国槐带化病、柿树带化病等巢式PCR检测成功结果，但因其地域局限性及试验重现性低等原因，使得部分林木植原体病害病原分子检测研究具有一定难度。今后可就上述问题从以下几方面着手：

(1)根据植原体病原浓度较低不易检测等问题，可将采样时间确定为温度较高的7-8月份，另外通过发展引入RT-PCR，提高直接PCR特异性及灵敏度。

(2)应针对不同植原体病害病原设计相应的巢式PCR特异引物，从而减少其产生的假阳性问题。

(3)就目前植原体分子检测手段发展形势，实时荧光PCR既能够保证巢式PCR灵敏性同时，又可以避免假阳性，另外还可以确定病菌浓度，因此对于林木植原体病害研究来讲具有较广的应用前景。