阿尔茨海默病中tau 蛋白的病理改变与治疗策略*

周 艳，储丹丹

（南通大学1 医学院生化与分子生物学系，2 教育部/江苏省共建神经再生重点实验室/神经再生协同创新中心，南通 226001)

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD)，俗称老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病[1]。AD 起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型；主要症状为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。目前全球有5 000 万人罹患AD，到2050 年预计患者总数将增加到1.52 亿。中国AD 患者人数居世界之最，到2050 年将超过2 000 万。可以预见在不久的将来，AD 将是中国医疗保健系统、家庭和社会的沉重负担。

AD 是多因素相关疾病，老化是其最主要的病因。AD 分为散发性和家族性，拥有共同的病理特征:患者大脑中神经元外大量β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ)沉淀形成的老年斑、神经元内大量的异常过度磷酸化的tau 聚集形成的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs)和广泛的神经元退化。一直以来在AD 研究领域都是以Aβ 为靶标作为药物开发的重点，遗憾的是该领域临床试验失败率高达99.6%[2]，所以寻找新的靶点非常必要。NFTs 的聚集是AD 另一病理特征，其数量和患者的痴呆程度呈明显正相关，被认为是AD 患者神经元纤维退化的病理基础[3]。研究tau 病理发生、发展的分子机制，开发以tau 为靶标的AD 药物，已成为当今AD 领域的研究热点。

1 Tau 蛋白的结构与功能

Tau 是大脑中与微管相关的主要蛋白质之一。人类tau 蛋白由位于染色体17q21.31 上的微管相关蛋白tau（microtubule associated protein tau，MAPT)基因编码。MAPT 基因由16 个外显子组成。在大脑中，外显子2、3 和10 的可变剪接产生6 种tau 亚型，包含0（0N)，1 个（1N)或2 个（2N)N 末端插入片段以及3 个（3R-tau)或4 个（4R-tau)C 末端微管结合重复序列[4]。人脑tau 的最长亚型由441 个氨基酸（2N4R，tau441)组成，分子质量为45.85 ku。Tau441包含4 个结构域，从N 端开始依次为:（1)从微管表面突出的N 末端突出结构域；（2)负责与SH3 结构域相互作用的脯氨酸富集区；（3)微管结合结构域，促进微管蛋白组装和tau 聚集；（4)C 末端[5]。

正常脑中tau 蛋白的功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束[6]。4R-tau 比3Rtau 具有更大的微管亲和力，在促进微管组装方面更有效。在AD 脑中，病理性tau 会从微管上脱离，使微管对katanin 之类的切割蛋白敏感，从而稳定性急剧下降。Tau 蛋白还可调节沿轴突的细胞内运输；或存在于细胞核中，应激反应时可能保护DNA 的完整性[4]。另外，tau 在少突胶质细胞和星形胶质细胞中也有表达[7]。然而，AD 中的tau 病理主要发生于神经元。

2 Tau 在AD 中的病理变化

随着AD 病程的进展，异常过度磷酸化tau 聚集形成的NFTs 呈现特定的进行模式，即Braak 分级[8-9]。早期tau 病理主要在脑干蓝斑核和内嗅皮层移行区（Braak Ⅰ～Ⅱ级)，而后进展到包括海马在内的边缘系统（Braak Ⅲ～Ⅳ级)，最后扩展到广泛的新皮层区域（Braak Ⅴ～Ⅵ)[8]。AD 脑内tau 聚集信号的进展模式与Braak 分级基本一致[9]。

AD 患者脑内tau 病理总是沿解剖联系路径进展的特定模式促使tau 朊样聚集和传播假设的提出:病理性tau 以自身为模板，诱导正常tau 蛋白发生构象改变，从而更易聚集并诱导周边更多tau 发生病理性改变，致使tau 病理向更广泛的脑区传播[10]。20 多年前即发现从AD 患者脑中分离的异常过度磷酸化的寡聚体tau 能猎获正常的tau，这种猎获依赖于tau 的磷酸化，并呈现不饱和性[11]。从2009 年开始，研究[10]发现病理性tau（特别是寡聚体tau)作为毒性种子，在体外和动物体内均能诱导正常的tau 聚集形成成束的纤维并在脑内传播，证实病理性tau具有朊样特性。

2.1 Tau 翻译后修饰与tau 病理 作为一种亲水性蛋白质，tau 包含许多丝氨酸/苏氨酸、脯氨酸、精氨酸/赖氨酸/组氨酸残基，易于磷酸化。除了磷酸化，tau 蛋白还含有多种翻译后修饰，包括截断、糖基化、泛素化、硝基化、甲基化、脂过氧化、磺酰化和乙酰化等[4]。翻译后修饰的失调与tau 病理的发生和朊样聚集传播密切相关。

2.1.1 Tau 的过度磷酸化 Tau 是一种磷酸化蛋白。Tau441 含有80 个丝氨酸/苏氨酸和5 个酪氨酸残基，这些残基均有被磷酸化的可能，在AD 中已鉴定出至少40 个丝氨酸/苏氨酸和2 个酪氨酸磷酸化位点。在AD 脑中，tau 的磷酸化水平提高了2～3 倍[12]。AD 脑中常见的tau 各种异常磷酸化位点，包括Thr181，Ser195，Ser198，Ser199，Ser202，Thr205，Thr212，Ser214，Thr217，Thr231，Ser235，Ser262，Ser353，Ser396，Ser400，Ser404，Ser409和Ser422等[2]。

Tau 的异常磷酸化是AD 和其他tau 病变疾病引起病理的关键因素[12]。根据磷酸化状态和溶解度，AD 脑中的tau 可分为:非过磷酸化的正常功能性tau（AD-tau)、异常过度磷酸化tau（AD P-tau，约40%以寡聚体形式存在于细胞质)和tau 聚合形成的不溶性双螺旋丝（paired helical filaments，PHF-tau)。正常tau 蛋白具有“回形针”结构，其中N 和C 末端在微管结合域上方折叠以防止蛋白质自聚集[5]。Tau 的过度磷酸化改变了蛋白质的电荷和构象，暴露微管结合域，从而导致tau 蛋白的聚集，使其正常的促进微管组装功能受损[12]。AD P-tau 还能够猎获其他与微管相关的蛋白质，如微管相关蛋白（microtubule-associated proteins，MAP)1 和MAP2，进一步破坏微管的组装。不溶性PHF-tau 则对微管组装没有影响，表明异常过度磷酸化的tau 寡聚体而非不溶性高聚体具有细胞毒性。用蛋白磷酸酶对AD P-tau 进行去磷酸化可恢复tau 体外促进微管装配的生物学活性，并减少体内的tau 病理，进一步表明异常过磷酸化在tau 病理中至关重要[13]。除了对微管稳定性有影响外，tau 的过度磷酸化还可能影响蛋白质降解、截断和聚集[14]。

Tau 在体内被脯氨酸指导的蛋白激酶[如糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β)，细胞周期蛋白依赖性激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5)，双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（dualspecificity tyrosine phosphorylation regulated kinase，DYRK1A)]和非脯氨酸指导的蛋白激酶（如钙离子钙调素依耐性蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶A、酪蛋白激酶1和微管亲和力调节激酶) 等磷酸化。在AD 脑中，这些激酶的活性或表达显著上升[4]。Tau 去磷酸化是由蛋白磷酸酶，主要是蛋白磷酸酶2A（protein phosphate 2A，PP2A)调节，占人脑中tau 磷酸酶活性的70%以上[15]。在AD 大脑中，tau 磷酸酶活性降到一半，加剧tau 的异常过度磷酸化[15]。因此，tau 激酶和磷酸酶活性之间的不平衡被认为是tau 过度磷酸化的根源。

2.1.2 Tau 的截断 作为一种内在无序的蛋白质（也称为天然未折叠的蛋白质)，tau 对蛋白酶消化敏感，在体外和体内均可被钙蛋白酶和其他蛋白酶裂解。Tau 的截断会破坏蛋白质的“回形针”结构并增加其过度磷酸化和形成聚集体的倾向[16]。已鉴定出tau 在AD 脑的NFTs 中至少有3 种特异性截断（Asn368、Glu391 和Asp421)，且与Braak 分级的进展相关。在不同的tau 病理小鼠模型中也发现了类似的截断[14]。

与NFTs 的C 端截断不同，tau 蛋白的N 端截断体与过度磷酸化的高分子质量tau 寡聚物相关[17]。本课题组[17-18]研究发现，AD 脑中过度磷酸化的高分子质量tau 聚集体缺少N 端部分，提示tau 发生了N端截断。截断tau 蛋白的N 端150 个或230 个氨基酸（amino acid，a.a.)可增强其位点特异性磷酸化、自我聚集及被AD P-tau 诱导的聚集，如仅截断前50个a.a.则无此效果。截断tau 蛋白C 端的50 个a.a.同样会增加tau 的位点特异性磷酸化，促进tau 自身聚集、被AD P-tau 捕获并进入聚集状态，但仅截断C端20 个a.a.不会产生上述效应。对tau 各种截断体的系统性分析表明，tau151-391 展现最强的病理活性[19]。因此，抑制tau 截断是抑制AD 和相关tau 蛋白病中tau 病理的潜在方法。

2.1.3 Tau 的O-连N-乙酰氨基葡萄糖（O-linked Nacetyglucosamine，O-GlcNAc)修饰 糖基化是将寡糖共价连接到蛋白质侧链的一种酶促过程。包括半乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸在内的几种寡糖可修饰人脑中的tau。通常，tau 被O-GlcNAcylated 修饰（单糖β-N-乙酰基葡糖胺修饰丝氨酸或苏氨酸残基的羟基)[20]。然而，来自AD 脑的tau 通过N-键异常糖基化（聚糖连接到天冬酰胺残基的酰胺基)[21]。AD 脑中，tau 的糖基化可能先于磷酸化，促进磷酸化发生[22]。相反，tau 的O-GlcNAcylation 通过竞争蛋白质上的磷酸化位点，使tau 磷酸化降低[20]。

2.1.4 Tau 的乙酰化 Tau 被组蛋白乙酰基转移酶p300 或CREB 结合蛋白乙酰化，并被组蛋白去乙酰化酶和组蛋白脱乙酰基酶6 脱乙酰化。Tau 还具有内在的乙酰转移酶活性，可以进行自乙酰化[4]。乙酰化修饰位点不同产生不同的tau 病理。例如，Lys274，Lys280，Lys281和Lys369的乙酰化会损害tau 功能，并在AD 脑中上调[23]。相比之下，KXGS 模体（motif)中的Lys259，Lys290，Lys321和Lys353通常被乙酰化以防止tau磷酸化和聚集，在AD 脑中这些位点的乙酰化水平降低[24]。

2.1.5 Tau 的泛素化 作为天然非折叠的蛋白质，正常的tau 降解可通过ATP/泛素非依赖性途径。尽管如此，tau 还可以被各种泛素连接酶泛素化，这些酶包括Hsc70 相互作用蛋白的C 端，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF)受体相关因子6 和促轴蛋白/MARCH7[25-26]。质谱分析显示，从AD 脑分离出的可溶性PHF-tau 在微管结合域的Lys254、Lys311和Lys353残基处泛素化，PHF 主要是单泛素化的而不是多泛素化的，这使其不足以诱导泛素-蛋白酶体系统介导的tau 聚集体的蛋白水解[27]。因此，增强tau 的多泛素化和降解可能是对抗tau 病理的潜在方法。

Tau 蛋白除了上述的翻译后修饰外，还能被小的泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier protein，SUMO)进行翻译后修饰，即SUMO 化；或发生糖化、硝基化等，这些修饰与tau 病理的关联尚需更多深入研究[4]。

2.2 Tau 的聚集 天然非折叠的tau 单体通常具有无规则卷曲结构，几乎不会形成聚集体[28]。部分折叠后，tau 蛋白则更多地形成β 折叠以助于tau 单体间的相互作用。Tau 微管结合重复序列上的两段六肽基序（275VQIINK280和306VQIVYK311)有促使其蛋白构象向β 折叠转变的倾向[6]。一旦触发了tau 单体的部分折叠，tau 便从稳定不活泼形式转变为具有催化活性的“种子”[29]，引发tau 依次聚集形成二聚体、可溶性低聚物、不溶性PHF 和最终NTFs。Tau 聚集成PHF 和NFTs 已在AD 和其他相关的神经退行性疾病中发现，其6 种亚型都可以在AD 脑的PHF中检测到[30]。

Tau 过度磷酸化和截断影响其聚集。首先，过度磷酸化可通过多种方式促进tau 聚集。（1)过度磷酸化的tau 从微管中分离出来，可为聚集提供更多的游离蛋白质。（2)过度磷酸化的tau 能以朊样方式将更多的正常tau 招募到聚集体中。（3)过度磷酸化的tau 可以改变tau 的降解和截断，间接影响tau 聚集。全长tau 蛋白仅仅过度磷酸化并不足以诱导不溶性聚集物的形成；只有在同时存在截断的情况下，过度磷酸化tau 才能被诱导形成聚集体[31]。而单纯的tau截断足以诱导tau 过度磷酸化和聚集体形成[16]。这些证据[32]表明，tau 的截断对于tau 聚集体的形成至关重要，其原因可能是截断暴露了微管结合重复序列，使单体间更容易接触。

2.3 病理性tau 的传播 病理性tau 传播包括毒性种子的摄取和释放，主要包含以下步骤:（1)细胞摄取病理性tau 种子；（2)以tau 种子为模板诱导细胞内正常tau 蛋白聚集；（3)新的病理性tau 种子的分泌；（4)病理性tau 种子跨细胞转移。

目前认为，细胞摄取病理性tau 种子的可能机制有:硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG)介导的内吞作用、外泌体融合、受体介导的内吞作用和巨胞饮[33]。其中，HSPG 介导的内吞作用研究较为深入。HSPG 覆盖所有细胞，参与介导细胞与其他细胞、信号分子和细胞外基质的相互作用。Tau 单体或聚集体可直接与细胞表面的HSPG 结合。HSPG 合成下降、干扰HSPG 硫酸化及裂解神经元的肝素均可阻止细胞摄取tau 单体或聚集体。另外，糖胺聚糖肝素等类似物可以掩盖tau 的HSPG 结合位点，从而阻止了其与细胞表面结合，抑制细胞摄取和传播病理性tau[33]。

被细胞摄取的病理性tau 种子以自身为模板诱导细胞内正常tau 蛋白聚集，形成新的病理性tau，并向其他细胞转移。Tau 聚集体直接释放、或者细胞膜的微小缺失，都可能会导致细胞外tau 聚集体结合到相邻细胞的表面并触发tau 聚集体的吸收。尽管tau 不包含信号肽，但它在生理条件下能够以单体和（或)截短的非磷酸化形式分泌，其释放的机制和功能尚不十分清楚。Tau 聚集体可以通过细胞膜破裂释放，胞吐作用，外泌体或通过与邻近细胞膜融合进行传播[34]。Tau 截断和过磷酸化有利于其分泌[35-36]。神经元活性的增加也可在体外刺激tau 释放，促进体内tau 病理传播[34]。在小鼠模型中，已证实tau 蛋白存在跨神经元运动[37]。另外，小胶质细胞同时吸收可溶和不可溶的tau，并可能通过外泌体促进tau 病理的播散[38]。这些结果表明，小胶质细胞介导的神经炎症也可能是tau 病理学传播的一种方式。

3 基于tau 的AD 疗法

迄今为止，美国食品和药物管理局仅批准了5种处方药用于治疗AD。这些药物中的3 种（多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明)是胆碱酯酶抑制剂，可防止脑内乙酰胆碱的分解。第4 种药物美金刚胺是一种非竞争性的N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂。第5 种药物是缓释多奈哌齐和美金刚的组合。然而，这些药物对症状的改善有限，且都不能阻止或减缓AD 的发展。随着对AD 中tau 病理发生发展机制了解的增多，越来越多的基于tau 病理机制、旨在减缓或阻止AD 进展的治疗方法得到了深入开发。

3.1 阻断tau 释放 通过阻断病理性tau 聚集体从细胞中的释放可以阻止跨细胞的传播。一方面，这个过程可能是由于细胞死亡或局部膜破裂而引发的。另一方面，如果蛋白质聚集体是非常规释放到细胞外，这在理论上是可以治疗的。目前，tau 释放机制还不清晰，尚无特定抑制剂可用于治疗AD。

3.2 抑制细胞摄取 目前已经提出的神经元摄取tau 聚集体的几种方式，多数机制尚不明确。以HSPG 介导tau 的结合和摄取为例，利用靶向HSPG的小分子抑制剂或结合tau 并抑制其与细胞表面结合的分子均可作为AD 潜在的治疗方法[33]。另外，功能性HSPG 需要在分泌途径中进行酶介导的成熟，因此相应的酶也可能成为有效靶点。

3.3 抑制tau 的过度磷酸化 Tau 的过度磷酸化是病理播种的基础，抑制其过度磷酸化可成为治疗方法之一。Tau 被激酶（如cdk5、GSK-3β、ERK 和Dyrk1A)磷酸化；其磷酸酶主要是PP2A，70%以上的tau 去磷酸化由PP2A 催化[15]。在小鼠模型中，一种针对GSK-3β 的特异性抑制剂氯化锂和cdk5，ERK1、GSK-3β非特异性抑制剂K252a，可降低不溶性和过度磷酸化的tau[39]。还有抑制GSK-3β 的一些小分子化合物，如SRN-003-556、CHIR-98014SB 216763 和SB 216763目前处于临床前阶段。靶向PP2A 的几种药物目前正在进行开发或临床评估[2]。

3.4 免疫疗法 靶向tau 病理的一种有前途的方法是免疫治疗，即用抗体结合病理性tau 蛋白并促进其清除。免疫疗法的原理主要基于两条途径:首先，tau病理主要影响的脑细胞——神经元，可以从细胞外液中提取抗体。被细胞吸收的抗体有利于细胞内病理性tau 的清除。其次，病理性tau 蛋白已证明可从细胞中释放出来并被邻近的细胞吸收。抗体则可能在细胞外与病理性tau 结合并阻止其扩散。目前，超过10 个tau 蛋白靶向候选药物正在进行临床试验[2]。

免疫治疗策略有主动和被动两种，各有利弊。主动免疫策略是给机体提供目标蛋白和佐剂以激发免疫反应。使用这种策略，机体自发产生抗体，效果持续时间长。然而，在AD 患病情况下触发免疫反应，面临较大的不良反应风险。被动免疫策略则直接给予患者tau 特异性抗体，这种方法会降低不良反应风险，但效应不够持续。集中施用抗体可以有效清除转基因小鼠脑内的病理性tau 蛋白。有两种抗体作用于tau 蛋白氨基末端，可在体外促进小胶质细胞摄取tau 蛋白抗原抗体混合物，进而清除tau 聚集体。另一种抗体靶向识别tau 微管结合重复序列，直接抑制神经元摄取tau 聚集体，但不会影响小胶质细胞的摄取[40]。总体而言，不同的抗tau 抗体有不同机制，针对大小不同的聚集体产生不同的清除效果。

3.5 细胞内清除 长期以来，提高tau 聚集体的清除率也是治疗的一个目标[41]。异常或错误折叠的蛋白质和衰老、受损细胞成分主要经由泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径清除。泛素蛋白酶体途径主要降解细胞短寿命蛋白，而自噬溶酶体途径则消化细胞质中的长寿命胞质蛋白和受损的细胞器。众多研究[42-43]证明泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径均参与tau 的降解。可溶性tau 和聚集的tau 都可以通过自噬而降解。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可导致细胞tau 蛋白积累，促进tau 蛋白的聚集而产生毒性作用[44]，而用自噬的激活剂雷帕霉素则减少了tau 的聚集，改善了其病理变化[45]。然而，长期服用自噬激活剂给AD 患者带来的不良反应尚待观察。

反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASOs)和RNA 干扰也是重要的清除细胞内毒性蛋白的方法。ASOs 可治疗与细胞内蛋白聚集相关的多种神经退行性疾病[46]。以tau 为靶标的ASOs 可降低小鼠tau 的病理和传播活性[47]。

3.6 抑制细胞内播种 进入细胞后，病理性聚集的tau 充当正常tau 蛋白的模板，诱导毒性寡聚体形成。直接抑制tau 毒性寡聚体可以采用多种机制，包括稳定单体、抑制原纤维生长、加速聚集以形成聚集度更大而毒性更小的组件、减少原纤维断裂或基于细胞内tau 聚集机制的其他新方法。例如，热休克蛋白70/40 伴侣系统可以分解原纤维，从而阻止其继续生长[48]。然而，哪些亚型可成为治疗的靶标以抑制相应蛋白聚集尚需要深入研究。

自从1986 年首次发现tau 在PHF 中异常磷酸化以来，tau 在AD 脑中发生的许多病理变化不断被发现，主要包括过度磷酸化、截断、聚集、播种和扩散[49]。Tau 低聚物而非纤维状聚集体是破坏突触功能、导致神经元死亡和tau 病理发展的细胞毒性物质。因此，在形成PHF 和NFTs 之前的早期，检测和清除有毒的tau 低聚物将成为预防和延缓AD 病程发展的重要途径。