miR-7977、NR4A1在狼疮性肾炎肾组织中的表达及意义

张 丹，李国祝，王春蕾

系统性红斑狼疮为自身免疫性疾病，好发于生育期女性，常伴肾脏免疫复合物沉积[1]。肾小球系膜细胞在免疫调节中具有重要作用，受免疫复合物沉积的影响，可激活并释放炎性因子，导致巨噬细胞、T淋巴细胞、树突状细胞浸润，引起并放大炎症反应，加重肾脏损伤[2]。狼疮性肾炎(LN)作为系统性红斑狼疮最常见、最严重的并发症，可进展为终末期肾脏病，及时、准确治疗对患者预后具有重要意义[3]。microRNA(miRNA)是一种高度保守的内源性小RNA，可调控靶基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等过程。近年有学者指出，miRNA在LN发病机制中占据重要地位[4]。核受体亚家族4A组成员1(NR4A1)是一种早期基因产物，广泛参与生物的生长、代谢及炎症调控。有研究发现，NR4A1可能参与LN的发生发展[5]。基于此，本研究选取126例系统性红斑狼疮为研究对象，评估患者肾组织miR-7977、NR4A1的表达水平及与LN病理分型的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年3月—2019年4月我院收治的126例系统性红斑狼疮为研究对象。根据肾穿刺活组织病理检查结果将系统性红斑狼疮患者分为LN组与非LN组。根据国际肾脏病学会/肾脏病理学会工作组制定的病理分型标准[6]，评估LN患者的病理分型，分为轻微病变型LN(Ⅰ型)、系膜增生性LN(Ⅱ型)、局灶性LN(Ⅲ型)、弥漫性LN(Ⅳ型)、膜性LN(Ⅴ型)、硬化性LN(Ⅵ型)。

1.2纳入与排除标准

1.2.1纳入标准：符合美国风湿病学会制定的系统性红斑狼疮诊断标准[7]；均行经皮肾穿刺活组织病理检查；患者及家属均签署知情同意书；经医院医学伦理委员会审批。

1.2.2排除标准：原发性肾脏病或其他继发性肾脏病；近3个月行外科手术或有外伤史；合并内分泌系统或血液系统疾病；伴恶性肿瘤；合并脑血管意外或狼疮性脑病；慢性传染病或活动性感染性疾病；妊娠、哺乳或更年期妇女。

1.3方法

1.3.1miR-7977表达检测：126例系统性红斑狼疮进行经皮肾穿刺活组织病理检查，取肾组织冷冻研磨后，使用miRNA提取试剂盒(德国QIAGEN)提取总RNA，使用逆转录试剂盒(德国QIAGEN)将1 μg RNA逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR试剂盒(德国QIAGEN)，以U6作为内参，检测miR-7977表达情况，按照2-ΔΔCt法计算相对表达量[8]。

1.3.2NR4A1表达检测：取肾组织石蜡标本4 μm连续切片后脱蜡水化，经3%过氧化氢孵育、PBS冲洗、微波法抗原热修复，然后滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育；分别滴加一抗工作液(上海瑞齐生物技术有限公司)4 ℃孵育过夜，复温后PBS冲洗，滴加二抗工作液(羊抗兔，南京生兴生物技术有限公司)，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗后滴加适量DAB；苏木素复染5 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，镜检。免疫组织化学评分方法：①根据视野内阳性细胞所占百分比计分，0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(25%～50%)、3分(50%～75%)、4分(≥75%)；②根据阳性细胞着色程度评分，0分(无色)、1分(淡黄色)、2分(棕黄色)、3分(棕褐色)。每张切片随机选取5个400倍视野，各视野上述2项评分相加，计算5个视野平均分，即为NR4A1表达评分。

1.4观察指标 比较两组肾组织miR-7977表达量及NR4A1表达评分差异，评估miR-7977表达量和NR4A1表达评分对LN的诊断价值，分析miR-7977表达量、NR4A1表达评分与LN患者病理分型的相关性。

2 结果

2.1基线资料比较 126例系统性红斑狼疮中，确诊LN 58例(46.03%)，未发生LN 68例(53.97%)。两组性别、年龄、病程、体质量指数(BMI)比较差异无统计学意义(P>0.05)。LN组肾小管萎缩、间质纤维化发生率均高于非LN组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 发生和未发生LN的系统性红斑狼疮两组基线资料比较

2.2肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分比较 LN组肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分均高于非LN组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 发生和未发生LN的系统性红斑狼疮两组肾组织miR-7977、NR4A1表达水平比较

2.3肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分对LN的诊断价值分析 肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分对LN均有较高诊断价值(AUC分别为0.888、0.897)，最佳截断值分别为0.34、3.50分。见表3、图1。

表3 肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分诊断LN的ROC曲线分析

2.4不同病理分型LN患者肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分比较 58例LN中，病理分型为Ⅱ型7例(12.07%)，Ⅲ型11例(18.97%)，Ⅳ型25例(43.10%)，Ⅴ型15例(25.86%)。不同病理分型LN患者肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同病理分型LN患者肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分比较

2.5肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分与LN患者病理分型的相关性 肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分与LN患者病理分型无明显相关性(r=0.127、0.131，P=0.275、0.263)。

3 讨论

据文献报道，LN的发生包括多个环节，如抗DNA抗体与免疫复合物诱导肾脏损伤、B淋巴细胞产生致病性自身抗体、辅助性T淋巴细胞参与激活B淋巴细胞、核小体增多或异常核小体出现等[9]。故体液免疫、细胞免疫、炎症反应等多种病理过程均参与LN的发生发展。近年来，miRNA在肾脏疾病中的作用受到学术界广泛关注，部分miRNA可介导细胞因子信号传导抑制蛋白1的表达及促纤维化蛋白的生成，从而诱导LN发生[10-11]。目前miR-7977相关研究较少，但外国学者指出，miR-7977在LN中表达水平明显升高，miR-7977可能参与LN发病机制[12]。NR4A1表达可被多种细胞因子调控，在机体生理、病理过程中发挥重要作用，现认为NR4A1可通过调控炎性细胞参与动脉粥样硬化发病过程，且在肿瘤细胞增殖及凋亡中具有调控作用，NR4A1介导细胞凋亡也成为肿瘤治疗的新靶点[13]。也有学者指出，NR4A1可通过介导PI3K/AKT信号通路，在肾脏疾病的发生发展中发挥作用[14]。因此，miR-7977及NR4A1可能与LN发病机制相关。本研究就肾组织miR-7977、NR4A1表达对LN的诊断价值及与病理分型的关系展开分析，为LN的临床诊疗提供参考。

本研究结果显示，LN组肾小管萎缩、间质纤维化发生率均高于非LN组。这也与LN患者弥漫性增生致肾小球坏死性病变及肾小管间质病变更为严重有关[15-16]。LN组肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分均高于非LN组，即LN患者肾组织miR-7977、NR4A1表达水平均升高。推测该结果由以下2种因素引起：①miR-7977可调节炎性介质释放及淋巴细胞功能，肾组织miR-7977表达升高，使炎性介质释放增多、免疫系统紊乱加剧，加速弥漫性增生性病变发生，引起LN[17]；②NR4A1可介导T淋巴细胞凋亡，并调控炎症反应，肾组织NR4A1表达升高，也提示自身免疫性疾病及炎症反应更严重，更易发生LN[18]。本研究也发现，肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分对LN均有较高诊断价值。提示miR-7977、NR4A1能够用于LN的临床诊断。肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分诊断LN的最佳截断值分别为0.34、3.50分，可供临床参考。

此外，LN病理分型中以Ⅳ型最严重，具有系膜细胞及内皮细胞弥漫性增生病变，常伴坏死性血管炎及血栓形成，严重影响患者肾功能[19]。本研究发现，Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型LN患者肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分略低于Ⅳ型患者，但组间比较差异无统计学意义。这也提示miR-7977及NR4A1可能在病变较轻的LN患者肾组织中表达水平低，但由于本研究样本量有限，未得到显著性结论。SAKAI等[20]提出，miRNA可通过多种途径参与LN的病情进展，可作为LN治疗的新靶点。然而本研究发现，LN患者肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分与病理分型无明显相关性，这也可能与本研究样本量较少，结果存在偏倚有关。因此，肾组织miR-7977、NR4A1表达对评估LN病情进展有一定参考价值，但与病情进展的关系仍需后续研究证实。

综上所述，LN患者肾组织miR-7977、NR4A1表达明显升高，对LN诊断价值较高，或可作为LN诊疗的新靶点。