紫锥菊中菊苣酸大孔吸附树脂纯化工艺的优化

张天锡，史 磊，冯 帅，杨 敏，李 健，李 峰*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院药学部,山东 济南 250014)

紫锥菊Echinaceapupurea(L.)Moench.来源于菊科紫锥菊属多年生草本植物[1]，具有显著的免疫促进作用和抗细菌、抗病毒感染能力，其提取物在欧美被广泛应用于药品、营养补充剂、保健食品中[2-5]，它含有多种成分，如酚酸衍生物、烷基酰胺、多糖、挥发油、生物碱、黄酮、多炔等[6-7]。国内大多以紫锥菊的地上部分为原料[8-9]，其乙醇提取物含有丰富的咖啡酸衍生物[10-12]，其中菊苣酸已被证实具有抗呼吸道合胞病毒(RSV)[13]、抗流感、提高免疫作用[14-17]。吴启林[18]采用大孔吸附树脂纯化菊苣酸，测定其纯度为20.2%左右；曾栋[19]以同法纯化该成分，7%甲醇洗脱后发现其纯度为36%，可知纯度不高、纯化过程中损失较多是目前阻碍其大规模生产应用的关键因素。因此，本实验优化紫锥菊中菊苣酸大孔吸附树脂纯化工艺，以期为该成分进一步开发利用提供依据。

1 材料

1.1 药材 紫锥菊购自青州市康达中药材种植专业合作社(批号2019072432)，经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为菊科植物紫锥菊属紫锥菊Echinaceapupurea(L.)Moench的干燥地上部分。

1.2 仪器 Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；CPA 2250型电子分析天平(十万分之一，德国赛多利斯公司)；TDL-5-A型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.3 试剂与药物 AB-8、HPD600、HPD826、D101、DM130、HPD100型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，物理性能见表1。菊苣酸对照品(批号111752-200902，纯度≥98%，中国食品药品检定研究院)。甲醇(批号190259)、乙腈(批号AS1122-801)为色谱纯(美国Fisher公司)；其余试剂均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)。

表1 大孔吸附树脂物理性能

2 方法与结果

2.1 菊苣酸含量测定

2.1.1 色谱条件 参照文献[20]报道。ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相0.2%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，程序见表2；体积流量1.5 mL/min；检测波长330 nm；柱温35 ℃；进样量5 μL。色谱图见图1。

表2 梯度洗脱程序

1.菊苣酸图1 菊苣酸HPLC色谱图

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取菊苣酸对照品适量，置于25 mL棕色量瓶中，70%甲醇溶解并定容至刻度，即得(菊苣酸质量浓度为0.6 mg/mL)。

2.1.3 供试品溶液制备 药材粉碎后过60目筛，取细粉约0.4 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-0.5%磷酸(5∶1)混合溶液75 mL,称定质量，室温下超声提取60 min，混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，收集滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液100、200、400、500、600、1 000 μL，置于1 mL量瓶中，70%甲醇定容至刻度，制成系列质量浓度溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以菊苣酸质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得到方程为Y=15.432X-212.44(r=0.999 6)，在60～600 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.4”项下溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得菊苣酸峰面积RSD为0.26%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一批药材干燥粉末，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得菊苣酸含量RSD为1.87%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液1份，精密移取1 mL至EP管中，加入2 mL 70%甲醇醇沉5 min后定容至5 mL，于0、2、4、6、8、12 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得菊苣酸峰面积RSD为0.68%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取同一批药材干燥粉末，精密称取0.400 0 g，精密加入适量“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得菊苣酸平均加样回收率为101.61%，RSD为2.3%。

2.2 单因素试验

2.2.1 上样液制备 取药材700 g，60%乙醇回流提取3次，设定料液比分别为1∶10、1∶8、1∶6，提取时间分别为1.5、1、1 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味，离心，取上清液，调节pH至2，抽滤，即得。

2.2.2 大孔吸附树脂预处理 取适量树脂，95%乙醇浸泡24 h后洗至溶液无白色秽浊异物，再用蒸馏水洗至无醇味，备用。

2.2.3 大孔吸附树脂类型筛选 将AB-8、HPD600、HPD826、D101、DM130、HPD100型树脂预处理后进行抽滤，分别精密称取1.000 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，加入含2.7 mg/mL菊苣酸的上样液20 mL，置于摇床中静态吸附，转速80 r/min，12 h后吸取上样液，HPLC法测定菊苣酸含量。过滤树脂后，去离子水清洗树脂表面残存溶液，再转移到另一具塞锥形瓶中，加入30%乙醇50 mL，置于摇床中解吸附12 h，解吸液在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以菊苣酸比吸附量、解吸量、解吸率为指标筛选树脂类型，结果见表3，可知HPD-100、HPD-826、AB-8型吸附量均较大，但前两者解吸量、解吸率较低，故最终确定为AB-8型。

表3 6种大孔吸附树脂对菊苣酸比吸附量、解吸量、解吸率的影响(n=3)

2.2.4 静态吸附曲线绘制 称取AB-8型树脂5 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，加入200 mL上样液进行静态吸附，每10 min取样1次，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，绘制静态吸附曲线，结果见图2。由此可知，随着吸附时间延长，树脂吸附量逐渐增大，前期较快，后期较慢，吸附平衡时间为180 min，最大吸附量为80 mg。

图2 AB-8型树脂静态吸附曲线

2.2.5 上样液pH筛选 由于菊苣酸在pH低于2时极易分解，稳定性差，故选择pH高于2的条件进行考察。将上样液(pH=5.6)平均分为6份，每份20 mL，6 mol/L HCl、10%NaOH溶液分别调pH至相应值，置于含1 g AB-8树脂的250 mL具塞锥形瓶中，摇床上静态吸附12 h，取样检测。过滤树脂，去离子水清洗树脂表面残存的溶液，转移至已包好锡箔纸的250 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL 30%乙醇解吸12 h，洗脱液在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算比吸附量、解吸量、解吸率，结果见表4。由此可知，当pH为2时AB-8型树脂比吸附量、解吸量最大。

表4 上样液pH对菊苣酸比吸附量、解吸量、解吸率的影响(n=3)

2.2.6 上样液质量浓度筛选 量取pH为2的上样液200 mL，以2 BV/h的体积流量加到径高比1∶5的树脂柱内循环吸附3 h，收集循环液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算吸附量、吸附率，结果见表5。由此可知，随着上样液质量浓度增加，吸附量呈递增趋势，但泄漏量也随之增大，从而大大降低吸附效率，增加生产成本，最终选择2～3 mg/mL作为上样液质量浓度。

表5 上样液质量浓度对菊苣酸吸附量、吸附率的影响(n=3)

2.2.7 上样体积流量筛选 量取4份质量浓度2.62 mg/mL、pH 2的上样液，于径高比1∶5的层析柱内调节吸附速度为相应数值，循环吸附3 h，量取500 mL蒸馏水至层析柱中，洗去树脂表面残存的上样液，收集水液与流出液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算吸附量、吸附率，结果见表6。由此可知，随着上样体积流量增加，树脂吸附量逐渐降低，吸附率也随之减少，为确保树脂的最大吸附量，最终选择2 BV/h作为上样体积流量。

表6 上样体积流量对菊苣酸吸附量、吸附率的影响(n=3)

2.2.8 径高比筛选 选取径高比1∶3、1∶5、1∶7、1∶9的玻璃柱，以AB-8型树脂进行湿法装柱，调节上样体积流量为2 BV/h，量取200 mL药液至层析柱中，收集液循环吸附3 h，再量取500 mL蒸馏水至层析柱中，洗去树脂表面残存上样液，收集水液与流出液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算吸附量、吸附率，结果见表7。由此可知，径高比越大，吸附率越高，故不能作为选择径高比的指标，可改为比吸附量，当径高比为1∶5时最大，最终选择1∶5作为径高比。

表7 径高比对菊苣酸吸附量、吸附率的影响(n=3)

2.2.9 泄露曲线绘制 量取适量树脂装入层析柱中，使其径高比为1∶5，量取400 mL 质量浓度为2.76 mg/mL、pH为2的药液加到层析柱中，以2 BV/h体积流量进行动态吸附，每只试管收集10 mL流出液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，绘制泄露曲线，结果见图3。由此可知，在上样量为100 mL时发生泄漏；为130 mL时，泄漏量为菊苣酸原质量浓度的10%，为确保该成分吸附完全，最终选择130 mL作为上样量，即4 BV。

图3 菊苣酸泄露曲线

2.2.10 洗脱剂(乙醇)体积分数筛选 表8显示，在乙醇体积分数为30%、50%时，菊苣酸解吸量、解吸率较大，考虑到经济因素，最终选择30%作为洗脱剂体积分数。

表8 洗脱剂体积分数对菊苣酸解吸量、解吸率的影响(n=3)

2.2.11 洗脱体积流量筛选 量取上样液130 mL，置于径高比1∶5的层析柱中，以2 BV/h体积流量循环吸附3 h，加入蒸馏水3 BV(pH=2)，当流出液经Molish反应呈阴性时，加入500 mL 30%乙醇，在2、3、4 BV/h体积流量下洗脱，收集洗脱液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算解吸量、解吸率，结果见表9。由此可知，在2、4 BV/h体积流量下解吸率相近，考虑到经济效益，最终选择4 BV/h作为洗脱体积流量。

表9 洗脱体积流量对菊苣酸解吸量、解吸率的影响(n=3)

2.2.12 洗脱曲线绘制 设定解吸条件为上样液质量浓度为2.7 mg/mL，pH为2，上样体积流量为2 BV/h，上样体积为130 mL，取3份上样液至径高比为1∶5的层析柱中，动态循环吸附3 h，加入3 BV蒸馏水使流出液经Molish反应呈阴性，加入30%乙醇洗脱，收集洗脱液，每管10 mL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，绘制洗脱曲线，结果见图4。由此可知，洗脱体积为11 BV时可将菊苣酸完全洗脱下来，并且该成分富集化部位主要集中在5 BV，此时其纯度为36.5%，解吸率为80.2%，故选择5 BV作为洗脱体积。

图4 菊苣酸洗脱曲线

2.3 正交试验 在单因素试验基础上，选择上样液质量浓度(A)、上样液pH(B)、洗脱体积流量(C)、洗脱剂体积分数(D)作为影响因素，解吸率(Y)作为评价指标，因素水平见表10，结果见表11，方差分析见表12。由此可知，各因素影响程度依次为D>B>A>C，最优工艺为A3B2C2D3，即上样液质量浓度3 mg/mL，上样液pH 3，洗脱体积流量3 BV/h，洗脱剂体积分数35%。

表10 因素水平

表11 试验设计与结果

表12 方差分析

2.4 验证试验 将“2.3”项下结果进行3批验证试验，结果见表13。

表13 验证试验结果(n=3)

3 讨论

本实验创新之处在于大孔树脂洗脱溶剂的选择较前期文献有所改进，采用纯化水(pH=3)、不同体积分数乙醇梯度洗脱的方式进行除杂，既减少了菊苣酸在纯化过程中的损失，又能使该成分洗脱富集化，从而其平均纯度可达到52.00%，较纯化前提高了近8倍。但菊苣酸对温度较敏感，在洗脱液减压浓缩过程中温度过高会造成该成分损失较大，故今后将系统考察温度对其稳定性的影响。

综上所述，紫锥菊中菊苣酸最优大孔吸附树脂纯化工艺为AB-8大孔吸附树脂，上样液质量浓度3 mg/mL，上样液pH 3，洗脱体积流量3 BV/h，洗脱剂体积分数35%，洗脱体积5 BV，能达到较好的分离纯化效果，具有成分损失少、吸附量大、吸附速度快、易于解吸附、树脂再生处理简单、使用周期长等优点，适合大规模工业化生产。同时可有效地提高提取物中该成分纯度，为其后续精制奠定基础。