白花丹醌对白血病细胞DNA 甲基转移酶的作用

徐凯红 严笑 杨澍君 张怡 牧启田 徐志娟 欧阳桂芳

急性白血病患者老龄化呈上升趋势，因其难以 耐受常规化疗，去甲基化联合靶向药物已成为首选的治疗方案[1]。去甲基化药物通过清除启动区的甲基，使因高甲基化而关闭的抑癌基因重新表达，达到治疗的目的[2]。传统中药及一些来源于植物的提取物具有去甲基化的作用，相对于化学合成药物，其对正常组织损伤低，副作用小，如表没食子儿茶素没食子酸酯、白芦藜醇和槲皮素等[3-5]，在肿瘤治疗中的优势也越来越明显。白花丹醌是从白花丹根部分离出来的一种萘醌类化合物，具有抗癌、抗微生物的活性。本课题组前期研究证实了白花丹醌的体内外抗白血病作用，提示其可能成为一种新的抗白血病药物[6]。对白花丹醌药理作用的继续研究中我们发现，低浓度白花丹醌具有去甲基化的作用，故本研究将白花丹醌作用于人髓系白血病细胞株HL-60，探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和细胞株 白花丹醌（美国Sigma-Aldrich 公 司，批号P7262）；MTS 试剂盒（美国Promega 公司，批号G3582）；细胞基因组DNA 提取试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号MT0044）；细胞核蛋白提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号R0050）；DNA 甲基化定量试剂盒（艾德科技北京有限公司，批号A-P-1035）；DNA 甲基转移酶（DNMT）Activity/Inhibition Assay Ultra Kit（美国Epigentek 公司，批号P-3010）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Thermo Scientific公司，批号K1622）；SYBR Premix Ex TaqTM（Takara宝生物工程有限公司，批号RR820A）。人急性髓系白血病细胞系HL-60 细胞（上海中科院细胞库，批号TCHu 23）；引物（上海Sangon 生物工程有限公司）。

1.2 主要仪器 甲基化芯片Infinium Methylation EPIC 850K BeadChip 购自美国illumina 公司；iMark酶标仪购自美国Bio-Rad 公司；PCR 仪为美国ABI公司StepOnePlus 型；Thermo Heraeus 高速低温离心机；CO2培养箱均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 MTS 法检测HL-60 细胞生长 制备HL-60 细胞悬液接种于96 孔板内，每孔200μL，实验设置不同的白花丹醌作用浓度（0～2μmol/L），每组分别接种5 个重复孔，设2 个空白对照，作用HL-60 细胞24h后，加入MTS 20μL，于37℃培养箱孵育3h，用酶标仪在490nm 处检测吸光度值，计算细胞存活率（%）=[（给药组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）]×100%。

1.4 甲基化水平检测 收集HL-60 细胞，等量分装入5 个培养瓶，使白花丹醌0.8μmol/L（根据MTS 结果选定）分别作用0、6、12、18、24h，同时设立N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）预处理组（NAC 10mmol/L 预处理HL-60 细胞2h 后，再经白花丹醌0.8μmol/L 作用24h）。DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，并记录各样本的浓度。根据甲基化定量试剂盒说明书步骤，确定标准曲线斜率，再根据以下公式确定样品5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的含量。

1.5 DNMT 活性检测 白花丹醌0.8μmol/L 分别作用HL-60 细胞0、12、24、36h 后，收集细胞，按照核蛋白提取试剂盒提取各组细胞核蛋白，以BCA 法测定蛋白浓度，用DNMT Activity/Inhibition Assay Ultra Kit 测定经白花丹醌不同作用时间后总DNMT 活性。

1.6 逆转录-实时荧光定量PCR（RT-qPCR）测定DNMT mRNA 表达 白花丹醌0.8μmol/L 作用HL-60 细胞0、12、24、36h 后，Trizol 提取各组细胞总RNA，用Bio-Rad 酶标仪测定RNA 浓度和纯度。逆转录试剂盒将RNA 逆转成cDNA，再予以实时荧光定量PCR 检测DNA 甲基转移酶（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）mRNA 的表达，引物序列见表1。所有引物均在https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/证实其可靠性及真实性。扩增条件：95℃、1min，95℃、15s，60℃、30s，72℃、32s，40 个循环，根据2-ΔΔct值计算相对于内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达量。

表1 实时荧光定量PCR 检测甲基化转移酶引物序列

1.7 统计学方法 应用SPSS 26.0 软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（）表示，实验独立重复3 次，两组数据间比较采用独立样本t 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 确定白花丹醌去甲基化作用的研究浓度 用不同浓度（0～2μmol/L）白花丹醌作用HL-60 细胞24h，MTS 法发现白花丹醌浓度≥1.2mol/L 会对细胞生长产生明显抑制作用（P＜0.05）（见表2）。因此选取白花丹醌浓度0.8μmol/L 作为不影响细胞生长的研究浓度。

表2 不同浓度白花丹醌对HL-60 细胞生长影响（%，）

表2 不同浓度白花丹醌对HL-60 细胞生长影响（%，）

注：与白花丹醌浓度0μmol/L 比较，aP＜0.05

2.2 白花丹醌对HL-60 细胞甲基化水平影响 DNA甲基化是DNMT 酶类把一个甲基共价连接到胞嘧啶的5 号碳原子上，形成5-mC。因此，通过5-mC 定量检测来反映甲基化水平。低浓度（0.8μmol/L）白花丹醌作用于HL-60 细胞，发现5-mC 水平随着白花丹醌作用时间延长而降低，作用18h 出现明显差异（P＜0.05），作用24h 差异更加明显（P＜0.01），见表3。

表3 白花丹醌不同作用时间对HL-60 细胞5-mC 的影响（ng，）

表3 白花丹醌不同作用时间对HL-60 细胞5-mC 的影响（ng，）

注：5-mC 为5-甲基化胞嘧啶；与白花丹醌作用0h 比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

2.3 活性氧（ROS）在白花丹醌去甲基化中的作用与对照组比较，单纯白花丹醌0.8μmol/L 作用于HL-60 细胞24h，甲基化水平明显下降（P＜0.01）。若先予NAC 10mmol/L 预处理，再予白花丹醌0.8μmol/L 作用24h，结果显示，白花丹醌的去甲基化作用被明显抑制（P＜0.05）。见表4。

表4 NAC 对白花丹醌去甲基化作用的影响（ng，）

表4 NAC 对白花丹醌去甲基化作用的影响（ng，）

注：NAC 为N-乙酰-L-半胱氨酸；与对照组比较，aP＜0.01；与白花丹醌组比较，bP＜0.05

2.4 DNMT 活性随着白花丹醌作用时间的延长而降低 白花丹醌0.8μmol/L 作用HL-60 细胞0、12、24、36h 后，提取核蛋白检测DNMT 活性。结果显示，与对照组比较，白花丹醌作用12h 后DNMT 活性明显下降（P＜0.05），随着作用时间延长，差异更加显著（P＜0.01），但是白花丹醌作用24h 和36h，DNMT 活性无明显差异（P＞0.05），见表5。

表5 低浓度白花丹醌作用不同时间对DNMT 活性的影响（OD·h-1·μg-1，）

表5 低浓度白花丹醌作用不同时间对DNMT 活性的影响（OD·h-1·μg-1，）

注：DNMT 为DNA 甲基化转移酶；与白花丹醌作用0h 比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

2.5 低浓度白花丹醌对HL-60 细胞甲基化相关基因表达的影响 利用RT-qPCR 技术提取不同作用时间的细胞总RNA，从mRNA 水平检测相关基因DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 的表达。除了DNMT3a 基因表达无明显差异外，DNMT1、DNMT3b 表达均受到白花丹醌不同程度的影响。白花丹醌作用12h 后，DNMT3b 的mRNA 相对表达水平降低（P＜0.05），作用24、36h，其表达水平进一步降低（P＜0.01）。白花丹醌作用36h，DNMT1 mRNA 相对表达水平明显降低（P＜0.05），见表6。

表6 白花丹醌对HL-60 细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA 相对表达水平的影响（）

表6 白花丹醌对HL-60 细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA 相对表达水平的影响（）

注：DNMT1 为甲基转移酶1；DNMT3a 为甲基转移酶3a；DNMT3b 为甲基转移酶3b；与白花丹醌作用0h 比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

3 讨论

白花丹醌是中草药提纯的化合物，早期研究证实对白血病细胞具有诱导凋亡的作用，作用24h IC50≈9μmol/L[7]。本研究发现，在低浓度（0.8μmol/L）不影响细胞生长的情况下，白花丹醌具有去甲基化的作用，这种作用至少需要经过18h 才能表现出显著性差异，符合去甲基化药物作用持续时间长、起效缓和的特点[8-9]。NAC 是细胞内还原型谷胱苷肽前体物的一种，可以显著促进细胞内还原型谷胱苷肽的合成而提高其含量，从而降低细胞内ROS 的水平；因此，NAC 常被用来做ROS 清除剂[10]。我们在前期研究中证实，ROS 是白花丹醌药理作用的主要中介物质，用NAC 阻断ROS，则几乎完全阻滞了白花丹醌诱导的凋亡[6]。本研究中我们同样对白花丹醌的ROS成分进行阻断，虽然去甲基化程度被大大减弱，NAC预处理组与空白对照组无明显差异，但是与白花丹醌组的差异程度要小于对照组与白花丹醌组之间的差异，提示阻断ROS 并不能完全消除白花丹醌的去甲基化作用，考虑白花丹醌去甲基化作用除了ROS主要介导外，可能还与直接影响甲基供体等其他作用方式有关[11]。

目前研究认为，DNMT 对介导和维持DNA 甲基化至关重要[12]。DNMT 主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b 及其亚型。DNMT1 具有维持甲基化的功能，对胚胎的正常发育至关重要；DNMT2 的生物功能目前尚不明确；DNMT3a 和DNMT3b 是催化从头甲基化的主要酶类，能够建立新的甲基化[13]。本研究从DNMT 活性和基因表达水平检测，均发现白花丹醌抑制DNMT 是其实现去甲基化的重要机制。但对于DNMT 不同亚型的抑制效率不同，对DNMT3b 的抑制效率最高，对DNMT3a 则在实验作用时间内未发现统计学上的差异，对DNMT1 则需要作用36h 才出现明显差异。DNMT1 表达水平的下降，与文献报道ROS 可以通过直接作用使5-mC 羟基化形成5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），进而干扰DNMT1 以阻断甲基化的形成，导致脱氧三磷酸胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）位点间接去甲基化的结果一致[14]。甲基化另一关键酶类是TET（ten-eleven translocation）家族蛋白[15]，它们能将5-mC 氧化修饰为5-hmC，经过后续一系列的碱基切除修复，从而实现DNA 的主动去甲基化。关于TET 酶类在白花丹醌去甲基化过程中的作用；具体哪些启动子区域出现了去甲基化；白花丹醌对体内骨髓造血细胞的真实影响，能否通过原代骨髓细胞培养或动物实验证实，我们将在后续做进一步的研究。