青藤碱调控NLRP3/caspase-1 通路抑制BV-2 小胶质细胞焦亡及炎症的机制研究

2021-12-23陈应丛王国涛徐道剑

浙江中西医结合杂志 2021年12期

陈应丛王国涛徐道剑

胶质细胞包括小胶质细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞，是神经系统的重要组成部分[1]。其中，小胶质细胞作为神经系统固有免疫细胞，在脊髓损伤过程中，小胶质细胞会被激活并且发挥重要的调控作用[2]。细胞焦亡（pyroptosis）是一种新发现的伴随炎症发生的程序性细胞死亡方式，分为依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-1）的经典途径和依赖caspase-4、5、11 等的非经典途径[3]。研究表明，脊髓损伤后，其小胶质细胞中caspase-1 表达明显上升[4]。因此，通过药物抑制细胞焦亡是脊髓损伤的一种潜在治疗方式。青藤碱是从我国传统中草药青风藤中提取的一种活性碱，具有止痛、抗炎及调节免疫等功能[5]。研究表明，青藤碱能通过抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）表达，减缓小鼠关节软骨退变[6]，但青藤碱对脊髓损伤的保护机制尚不明确。因此，本研究旨在探究青藤碱调控NLRP3/caspase-1 通路抑制BV-2 细胞焦亡和炎症的作用机制，以期为青藤碱治疗脊髓损伤的临床应用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 细胞 BV-2 小胶质细胞（中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，批号TCR14）。

1.2 主要试剂及仪器青藤碱试剂（武汉谷歌生物公司，批号115-53-7）；胎牛血清（德国SeraPro 公司，批号S601P-500）；DMEM/高糖培养基（美国HyClone 公司，批号SH30022.01B）；CCK-8 试剂盒（杭州苹谷生物公司，批号AG0063c）；Hoechst/PI 染色试剂盒（杭州苹谷生物公司，批号AG0045c）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成公司，批号A020-2-2）；抗小鼠一抗硫氧还蛋白结合蛋白（TXNIP）、NLRP3、caspase-1、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素18（IL-18）抗体（Abcam 公司，批号ab188865、ab263899、ab179515、ab213818、ab223293），抗兔二抗购自默赛飞公司（批号31234）。2802H 型紫外分光光度计（美国UNICO 公司，型号UV2800）；PCR 基因扩增仪（德国Eppendorf 公司，型号Mastercycler X50）；凝胶成像仪（美国Bio-RAD 公司，型号BIO-RAD Gel Doc XR+）；荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯公司，型号IX83）。

2 实验方法

2.1 细胞培养及分组将BV-2 细胞分为正常组、氧糖剥夺/复糖复氧（OGD/R）组和青藤碱组（20μmol/L）进行研究分组。正常组：BV-2 细胞用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/高糖培养基培养，并置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中。OGD/R 组：BV-2 小胶质细胞用Earle’s 平衡盐溶液培养，置于37℃、1%O2、5%CO2和94%N2的培养箱中培养6h，然后正常条件下继续培养。OGD/R+青藤碱组：BV-2 小胶质细胞用Earle’s 平衡盐溶液培养，置于37℃、1%O2、5%CO2和94%N2的培养箱中培养6h，然后用含20μmol/L 青藤碱、10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基继续培养。

2.2 给药剂量筛选及CCK-8 检测细胞活力 BV-2小胶质细胞经OGD/R 模型处理后，分别用0、10、20、50、100μmol/L 浓度的青藤碱干预48h。每孔加入10μL CCK-8 溶液，恒温培养箱内孵育2h，酶标仪检测490nm 处各孔的吸光度（OD），以OGD/R 组（0μmol/L 浓度的青藤碱干预组）为对照组，计算各组BV-2 小胶质细胞相对活性。

2.3 微量酶标法检测BV-2 小胶质细胞LDH 活性将正常组、OGD/R 组和青藤碱组BV-2 小胶质细胞分别用胰酶消化后，以1350r/min，离心5min。取120μL 上清液，再加入60μL LDH 检测液混匀，在避光条件下摇床孵育30min。酶标仪检测490nm 处各孔的吸光度（OD）。以正常组为参照，LDH 相对释放量=OD 检测组/OD 正常组。

2.4 赫斯特（Hoechst）/碘化丙啶（PI）染色法检测青藤碱对BV-2 细胞焦亡的影响将BV-2 小胶质细胞培养于6 孔板中，分别经过不同干预后，使用PBS洗涤3 次。将细胞染色缓冲液、Hoechst 溶液和PI 溶液以200∶1∶1 比例混匀形成工作液，每孔加入1mL 工作液，4℃避光反应30min，PBS 洗涤3 次后，使用荧光显微镜下观察细胞焦亡情况。

2.5 RT-PCR 检测BV-2 小胶质细胞基因表达分别选取正常组、OGD/R 组和青藤碱组BV-2 小胶质细胞操作。具体试验步骤按照Trizol 试剂盒说明书进行，在细胞中加入Trizol 试剂，室温静置10min；加200μL 氯仿混匀后，以12000r/min，4℃离心15min，取上层转移至EP 管；加等体积异丙醇，以12000r/min，4℃离心15min，取底部RNA 沉淀。用预热灭菌水溶解沉淀。取4μL 总RNA 加至200μL 灭菌水中，在紫外分光光度仪上测定其OD260 和OD280，计算OD260/OD280。反转录反应：在20μL 反应体积中进行，成分如下：总RNA 5μL，随机引物1μL，ddH2O 4.5μL，70℃固定浴10min；加10μL 逆转录反应液在42℃固定浴60min，99℃固定浴5min，-20℃保存备用。引物由上海生工生物技术有限公司提供，序列见表1。实时定量PCR 实验方法：使用宝生物工程（大连）有限公司生产的SYRB Premix ExTaqTM和ABI 7900 扩增仪进行荧光扩增；求出CT 值，检测TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 基因的表达情况。

表1 PCR 引物序列

2.6 Western blot 检测BV-2 小胶质细胞蛋白表达收集细胞，加入冰预冷的蛋白裂解液后混匀，超声破碎细胞，12000r/min，4℃离心15min 后，提取上层细胞蛋白，加入5X 上样缓冲液（体积比4∶1），100℃沸水中煮5min，-20℃备用。SDS-PAGE 电泳：按照胶配置方法配制不同浓度PAGE 胶，电泳置染料抵达分离胶底部，断开电源，取下凝胶，切取带有要转移蛋白泳道的凝胶。将分离后的蛋白电转移至PVDF 膜。封闭：转移结束后，在TBS-T 液内清洗20min，加5%脱脂奶粉，37℃封闭1h。一抗孵育：封闭结束后，用TBS-T 稀释第一抗体，将PVDF 滤膜置于其中，4℃震荡过夜。显迹：TBS-T 液漂洗PVDF 膜3 次/10min，将膜与TBS-T 稀释二抗孵育，室温下振荡1h；TBS-T漂洗PVDF 膜3 次/10min；TBS 液漂PVDF 膜3 次/10min，X 光胶片上曝光，随后显影、定影，用图像分析系统测定蛋白条带的光密度，定量分析TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白的表达情况。

2.7 统计学方法应用SPSS 13.0 统计软件进行分析，所有数据均以均数±标准差（）表示。多组间的差异比较采用单因素方差分析，为检验组间差异，方差分析后作Dunnett’s test。检验水准α 值取双侧0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 青藤碱对BV-2 小胶质细胞活性的影响用10、20μmol/L 青藤碱处理OGD/R 干预后的BV-2 小胶质细胞24h，BV-2 细胞活性无明显降低（P＞0.05）。50、100μmol/L 青藤碱处理OGD/R 干预后的BV-2小胶质细胞24h，BV-2 细胞活性明显降低（P＜0.05）。因此，后续实验选取20μmol/L 作为青藤碱的终浓度。见表2。

表2 不同浓度青藤碱对BV-2 小胶质细胞活性影响（%，）

注：OGD/R组为OGD/R诱导的BV-2小胶质细胞；10、20、50、100μmol/L 青藤碱组分别为OGD/R 干预后的BV-2 小胶质细胞用相应浓度青藤碱处理；OGD/R 为氧糖剥夺/复糖复氧；与OGD/R 组比较，aP＜0.05

3.2 青藤碱降低BV-2 小胶质细胞细胞焦亡的LDH表达 LDH 释放试验检测结果发现，与正常组比较，OGD/R 组细胞LDH 相对释放量明显升高（P＜0.05），20μmol/L 青藤碱处理后，OGD/R+青藤碱组BV-2 小胶质细胞LDH 相对释放量较OGD/R 组显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 青藤碱抑制OGD/R 诱导的BV-2 小胶质细胞LDH相对活性（）

注：正常组为正常培养的BV-2 小胶质细胞；OGD/R 组为OGD/R 诱导的BV-2 小胶质细胞；OGD/R+青藤碱组为OGD/R 诱导后，用含20μmol/L 青藤碱的高糖培养基培养的BV-2 小胶质细胞；OGD/R 为氧糖剥夺/复糖复氧；LDH 为乳酸脱氧酶；与正常组比较，aP＜0.05；与OGD/R 组比较，bP＜0.05

3.3 青藤碱降低BV-2 小胶质细胞的PI 阳性细胞数经Hoechst/PI 染色后，免疫荧光实验结果表明，与正常组比较，OGD/R 组BV-2 小胶质细胞中PI 阳性细胞数明显上升（P＜0.05），青藤碱作用于OGD/R诱导的BV-2 小胶质细胞后，细胞中PI 阳性细胞数明显降低（P＜0.05）。见图1 和表4。

图1 BV-2 小胶质细胞Hoechst/PI 荧光染色图（比例尺=500μm）

表4 青藤碱降低OGD/R 诱导的BV-2 小胶质细胞PI阳性细胞数（%，）

注：正常组为正常培养的BV-2 小胶质细胞；OGD/R 组为OGD/R 诱导的BV-2 小胶质细胞；OGD/R+青藤碱组为OGD/R 诱导后，用含20μmol/L 青藤碱的高糖培养基培养的BV-2 小胶质细胞；OGD/R 氧糖剥夺/复糖复氧；PI 为碘化丙啶；与正常组比较，aP＜0.05；与OGD/R组比较，bP＜0.05

3.4 青藤碱抑制TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA 的表达 RT-PCR 结果表明，OGD/R 组BV-2 小胶质细胞的TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 mRNA 表达较正常组明显上升（P＜0.05），而OGD/R 诱导的BV-2 小胶质细胞经青藤碱处理后，其TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 表达显著降低（P＜0.05）。见表5。

表5 青藤碱对TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 mRNA 表达的影响（）

注：正常组为正常培养的BV-2 小胶质细胞；OGD/R 组为OGD/R 诱导的BV-2 小胶质细胞；OGD/R+青藤碱组为OGD/R 诱导后，用含20μmol/L青藤碱的高糖培养基培养的BV-2 小胶质细胞；TXNIP 为硫氧还蛋白结合蛋白；NLRP3 为核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3；caspase-1为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1；IL-1β 为白细胞介素1β；IL-18 为白细胞介素18；与正常组比较，aP＜0.05；与OGD/R 组比较，bP＜0.05

3.5 青藤碱抑制NLRP3/caspase-1 通路的激活和细胞焦亡相关蛋白的表达 Western blot 结果表明，相对于正常组，OGD/R 组BV-2 小胶质细胞的TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表达较正常组明显上升（P＜0.05）；而与OGD/R 组比较，青藤碱能显著下调TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18蛋白表达水平（P<0.05）。见图2 和表6。

表6 青藤碱对TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表达的影响（）

图2 TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白印记图

4 讨论

炎症是脊髓损伤的重要生物学过程，及时抑制脊髓损伤后的炎症反应有利于改善脊髓损伤，促进脊髓修复[7-8]。近期有研究进一步表明，与炎症密切相关的细胞焦亡在脊髓损伤过程中发挥着重要的作用[9]。因此，通过药物抑制细胞焦亡及炎症是治疗脊髓损伤的可行方案。青藤碱提取于我国传统中草药青风藤，具有生物活性高等优点[5]，是近年来的研究热点。有研究表明，青藤碱能通过抑制NLRP3 治疗缺血性脑卒中、急性肝损伤、骨关节炎等疾病[10-12]。因此，本研究以青藤碱为研究对象，观察其对脊髓损伤模型中小胶质细胞NLRP3/caspase-1 通路的影响。

NLRP3/caspase-1 通路在细胞焦亡中发挥重要作用[13]。NLRP3 炎症小体是由Pro-caspase-1、NLRP3和凋亡相关微粒蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC）所组成的蛋白复合体，能进一步激活caspase-1。而活化的caspase-1能切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D 氮端活性域的肽段，该肽段能与细胞膜的磷脂蛋白相结合并促使细胞膜穿孔，细胞破裂，释放包含LDH 等细胞内容物，致使细胞焦亡[14]。本研究使用OGD/R 模型处理BV-2 小胶质细胞后，细胞LDH 释放量及Hoechst/PI 染色阳性细胞数较正常组明显提升，即细胞焦亡水平升高。然而，用合适浓度（20μmol/L）的青藤碱处理OGD/R 组的BV-2 小胶质细胞后，LDH 活性检测和Hoechst/PI 染色试验结果证实青藤碱能抑制细胞焦亡。另一方面，随着细胞焦亡通路中caspase-1 的激活，活化的caspase-1 能对IL-1β 和IL-18 前体进行切割，形成有活性的IL-1β 和IL-18，募集炎症细胞聚集，诱发级联放大的炎症反应[15-16]。为了进一步探究青藤碱抑制细胞焦亡的具体机制，本研究通过RT-PCR 和Western blot 技术检测细胞焦亡通路中关键因子TXNIP、NLRP3 和caspase-1 mRNA 和蛋白的表达。结果发现，青藤碱能够通过调控NLRP3/caspase-1 通路抑制BV-2 小胶质细胞焦亡及进一步的炎症反应。

综上所述，本研究表明，青藤碱可能通过调控NLRP3/caspase-1 通路抑制BV-2 小胶质细胞焦亡及炎症反应，为青藤碱的药理学研究和临床脊髓损伤的治疗提供了新的思路。