草地贪夜蛾幼虫对常用杀虫剂相对敏感基线的建立

王欢欢, 吕圣兰, 赵 瑞, 梁 沛, 张 帅,高希武, 张 雷,*, 谷少华,*

(1. 中国农业大学昆虫学系, 北京100193; 2. 全国农业技术推广服务中心, 北京 100026)

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda，又称秋黏虫，属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾属Spodoptera，原分布于美洲，最早记载于1797年，1856年报道为害棉花，1917年报道了其防治方法(Murúaetal., 2009; 李永平等, 2019)。该虫以多食性著称，具有很强的迁移和扩散能力，对玉米、小麦、水稻、高粱、甘蔗及棉花等多种作物造成严重为害(Casmuzetal., 2015)。2018年12月草地贪夜蛾从缅甸入境入侵我国云南省并迅速扩散，现已成为我国主要的入侵害虫之一(Sunetal., 2021)。

2000年之前，美洲地区对草地贪夜蛾以化学防治为主(Gutiérrez-Morenoetal., 2019)。由于抗药性问题，当地于2000年开始种植Bt抗虫玉米(表达Cry1F)，但自2007年起陆续在多个国家发现该虫对Cry1F产生抗性并导致Bt抗虫玉米防效下降(Storeretal., 2010; Xiao, 2021)，因此南美洲大部分地区又重新使用杀虫剂进行防控。目前草地贪夜蛾已对41种杀虫剂产生了不同程度的抗性，产生抗性的杀虫剂既包括有机磷类、拟除虫菊酯类等传统杀虫剂，也包括双酰胺类、多杀菌素等新型杀虫剂(APRD, 2019; Sparksetal., 2020)。入侵我国的草地贪夜蛾已经携带有高频率的对有机磷类和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性基因(李妍等, 2020; Zhangetal., 2020)。

由于我国尚未推广种植转基因玉米，目前对草地贪夜蛾防治主要依靠化学杀虫剂。但由于我国地域广阔，草地贪夜蛾在不同地区的发生情况不同，因此不同地区的用药品种、强度和频次也都存在差异，导致不同地区草地贪夜蛾种群对杀虫剂的抗性发展也不一致。因此，加强不同地区草地贪夜蛾抗药性水平监测，对于指导合理用药、有效治理草地贪夜蛾具有重要意义。而进行抗药性监测的前提就是建立靶标害虫对不同药剂的敏感基线(吴益东等, 2001)。虽然国外已经有草地贪夜蛾对杀虫剂敏感基线的相关报道(Yu, 1991; Yuetal., 2003; Gutiérrez-Morenoetal., 2019)，但这些敏感基线都是用室内绝对敏感种群建立，其敏感基线数据不宜用于我国草地贪夜蛾抗性监测和指导用药。

而国内目前尚无草地贪夜蛾对常用杀虫剂敏感基线的报道，因此迫切需要在草地贪夜蛾入侵我国初期、尚未产生明显抗药性之前建立可靠的敏感基线并进行抗性监测，以便准确掌握草地贪夜蛾田间种群的抗药性水平及发展动态，及时调整用药策略，在有效防治草地贪夜蛾的同时延缓其抗药性发展。鉴于不同研究人员进行草地贪夜蛾抗药性监测时所采用的生物测定方法不同，本研究分别采用点滴法、浸叶法和饲料药膜法3种常用生测方法建立了草地贪夜蛾对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)等6大类共7种常用杀虫剂的相对敏感基线，为草地贪夜蛾的抗药性监测及其抗药性治理提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

根据2019年中国草地贪夜蛾对杀虫剂的抗性监测结果(未发表数据)，选择其中最敏感的云南种群用于建立对甲维盐、乙基多杀菌素和四氯虫酰胺的敏感基线，海南种群用于建立对虫螨腈、虱螨脲和茚虫威的敏感基线，湖北种群用于建立对氯虫苯甲酰胺的敏感基线。3个种群均是2019年6月份采自当地玉米田。所有种群均在室内26±1℃、相对湿度70%±5%、光暗周期16L∶8D条件下用人工饲料饲养5～7代，期间不接触任何杀虫剂。

1.2 供试药剂及试剂

95%四氯虫酰胺(沈阳科创化学品有限公司)，99%乙基多杀菌素(陶氏益农中国有限公司)，92%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(河北沃德丰药业有限公司)，96%虫螨腈(江苏维尤纳特精细化工有限公司)，96%虱螨脲(瑞士先正达作物保护有限公司)，90%茚虫威(京博农化科技有限公司)，95%氯虫苯甲酰胺(苏州富美实植物保护剂有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)、丙酮均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，Triton X-100(美国Amresco公司)。

1.3 毒力测定

1.3.1浸叶法：参照中华人民共和国农业行业标准《NY/T 1154.14-2008农药室内生物测定试验准则杀虫剂第14部分：浸叶法》进行生物测定，略有改动。具体步骤为：将原药配制成母液，除氯虫苯甲酰胺用二甲基亚砜溶解外，其余原药均用丙酮溶解。然后用0.1% Triton X-100水溶液将母液按等比稀释成5～7个系列浓度，将喇叭口期的非转基因新鲜玉米叶片剪成长×宽=1 cm×1 cm的叶段。分别将叶段在不同浓度的药液中浸泡20 s后，放在滤纸上阴干后置于12孔培养板中，培养板每孔预先倒入1.5%琼脂1 mL保湿。每孔6个叶段，并接入1头3龄第2天幼虫。每处理重复3次，每个重复不少于12头幼虫。以0.1% Triton X-100水溶液处理为对照。根据不同药剂作用特点，双酰胺类药剂以及虱螨脲在处理后96 h检查结果，其余药剂均在处理后48 h检查结果。用毛笔轻触幼虫无反应则视为死亡。

1.3.2点滴法：参照中华人民共和国农业行业标准《NY/T 1154.1-2006农药室内生物测定试验准则杀虫剂第1部分：点滴法》进行生物测定，略有改动。具体步骤为：将原药配制成母液，除氯虫苯甲酰胺用二甲基亚砜溶解外，其余原药均用丙酮溶解。将配制好的母液再按等比稀释成5～7个系列浓度，用微量点滴器(Hamilton PB600-1)逐个点滴于3龄第2天幼虫(平均体重约0.005 g)的前胸背板上，每头点滴0.2 μL，将点滴后的试虫转入直径9 cm培养皿中，放入足量人工饲料正常饲养。每处理重复4次，每个重复10头幼虫，以相应溶剂点滴处理为对照。在处理后24 h检查结果，用毛笔轻触幼虫无反应或有明显的中毒症状(畸形、颤搐、停止取食等)则视为死亡。由于虱螨脲以胃毒作用为主，触杀作用差，所以本方法中未测定虱螨脲的毒力。

1.3.3饲料药膜法：参考Bolzan等(2019)的方法有改进。具体步骤为：将原药配制成母液，除氯虫苯甲酰胺用二甲基亚砜溶解外，其余原药均用丙酮溶解。将配制好的母液用0.1% Triton X-100水溶液等比稀释成5～7个系列梯度。在24孔培养板中，每孔分别加入冷却至60℃左右的液态人工饲料1 mL并放凉使其自然固化。然后每孔滴入50 μL不同浓度药液并均匀涂布于饲料表面，置于室温下晾干后每孔接入1头2龄幼虫。每处理重复4次，每个重复12头幼虫，以0.1% Triton X-100水溶液处理为对照。除虱螨脲在处理后96 h检查结果外，其余药剂均在处理后48 h检查结果，结果检查方法同1.3.2节。

1.4 数据分析

数据用POLO软件(LeOra Software Inc., California, 美国)进行统计分析，对照死亡率小于10%为有效测定，并用对照死亡率进行校正，求出毒力回归线Slope值及其标准误(SE)、致死中浓度(LC50)或致死中剂量(LD50)值及其95%置信限、卡方值(χ2)、自由度(df)以及P值。

2 结果

2.1 浸叶法测定的草地贪夜蛾3龄幼虫对7种杀虫剂的相对敏感基线

浸叶法测定结果表明，草地贪夜蛾3龄幼虫对甲维盐最敏感，LC50值为0.054 mg/L；对虱螨脲、四氯虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、乙基多杀菌素和虫螨腈等5种杀虫剂敏感性较高，LC50值均小于2 mg/L；对茚虫威敏感性中等，LC50值为12.131 mg/L。草地贪夜蛾对不同药剂的敏感性由高到低依次为甲维盐、虱螨脲、四氯虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、乙基多杀菌素、虫螨腈和茚虫威(表1)。

2.2 点滴法测定的草地贪夜蛾3龄幼虫对6种杀虫剂的相对敏感基线

点滴法测定结果表明，各药剂对草地贪夜蛾3龄幼虫的LD50值均在5 μg/g以下，其中对甲维盐最敏感，LD50值为0.355 μg/g，对氯虫苯甲酰胺和乙基多杀菌素次之，LD50值分别为0.410和0.518 μg/g。四氯虫酰胺、虫螨腈和茚虫威对草地贪夜蛾LD50值分别为1.244, 2.097和4.707 μg/g。草地贪夜蛾对不同药剂的敏感性由高到低依次为甲维盐、氯虫苯甲酰胺、乙基多杀菌素、四氯虫酰胺、虫螨腈和茚虫威(表2)。

2.3 饲料药膜法测定的草地贪夜蛾2龄幼虫对7种杀虫剂的相对敏感基线

饲料药膜法测定结果表明，草地贪夜蛾2龄幼虫对不同杀虫剂的敏感性差异较小，LC50值均在0.3 μg/cm2以下，其中对甲维盐最敏感，LC50值为0.003 μg/cm2。草地贪夜蛾对不同药剂的敏感性由高到低依次为甲维盐、虱螨脲、乙基多杀菌素、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺、虫螨腈和茚虫威(表3)。

表1 草地贪夜蛾3龄幼虫对7种杀虫剂的相对敏感基线(浸叶法)Table 1 Relative susceptible baselines of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperdato seven insecticides (leaf-dip method)

表2 草地贪夜蛾3龄幼虫对6种杀虫剂的相对敏感基线(点滴法)Table 2 Relative susceptible baselines of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperdato six insecticides (topical application)

表3 草地贪夜蛾2龄幼虫对7种杀虫剂的相对敏感基线(饲料药膜法)Table 3 Relative susceptible baselines of the 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperdato seven insecticides (diet surface overlay bioassay)

3 讨论

目前农业农村部推荐的多数防治草地贪夜蛾的药剂都兼具胃毒和触杀作用。不同生物测定方法所测得的害虫对杀虫剂的敏感性结果往往不同。点滴法主要测定杀虫剂的触杀作用，定量准确，是目前最为精准的测定方法；浸叶法与田间茎叶喷雾处理的效果最为接近，能够同时反映药剂的触杀和胃毒毒力；饲料药膜法测定的也是杀虫剂触杀和胃毒的联合作用。因此，这3种方法都能反映目前生产上主推药剂对草地贪夜蛾的毒力，因而在杀虫剂活性评价和抗性监测中被广泛使用。本研究以室内建立的云南、海南和湖北3个草地贪夜蛾相对敏感种群为材料，分别采用点滴法、浸叶法和饲料药膜法3种不同的生测方法建立了草地贪夜蛾对常用杀虫药剂的敏感基线，为建立完善的草地贪夜蛾抗药性监测体系，尽早开展抗药性监测工作提供支持。虽然本研究所用的云南、海南和湖北种群都是不接触杀虫剂的情况下连续饲养多代的相对敏感种群，但3个种群对不同药剂的敏感性还是存在一定差异。因此，我们在测定3个种群对7种常用杀虫剂敏感性的基础上，分别选择中国最敏感的种群建立相应敏感基线，如选择云南种群建立对甲维盐、乙基多杀菌素和四氯虫酰胺的敏感基线，选择海南种群建立对虫螨腈、虱螨脲和茚虫威的敏感基线，选择湖北种群建立对氯虫苯甲酰胺的敏感基线，以期为田间草地贪夜蛾的抗性监测提供最接近实际情形的敏感基线。

高祖鹏等(2020)以饲料药膜法测得氯虫苯甲酰胺对草地贪夜蛾的LC50值为4.52 mg/L，是本研究结果(表3)的4倍。鲁艳辉等(2020)以浸叶法测得氯虫苯甲酰胺对草地贪夜蛾的LC50值为4.483 mg/L，显著高于本研究中浸叶法测定的结果(表1)。上述差异主要是因为本研究所用相对敏感品系在室内不接触杀虫剂的情况下连续饲养了至少5～7代，而其他研究中所用草地贪夜蛾基本都是直接采自田间的种群，并非相对敏感种群。但这些结果也反映出我国的草地贪夜蛾田间种群已经对常用药剂产生了不同水平的抗性，更加凸显了尽快建立敏感基线、对草地贪夜蛾抗药性进行系统监测的紧迫性。而Lira等(2020)以浸叶法测得乙基多杀菌素对巴西草地贪夜蛾敏感品系的LC50值为0.63 mg/L，与本研究结果(表1)基本一致，说明本研究中建立敏感基线所选择的草地贪夜蛾品系是合适的。

由于草地贪夜蛾具有迁飞性和暴发性特点，化学杀虫剂将持续在其防治中扮演主要角色。而入侵我国的草地贪夜蛾种群本身已经携带高频率的抗性基因(李妍等, 2020)，加之目前以应急防控为核心的少数几种杀虫剂的大量、持续使用，必将加速草地贪夜蛾的抗药性发展。而且我国不同地区(如周年繁殖区、迁飞过渡区和重点防范区)因草地贪夜蛾发生情况不同，用药种类和频率也各不相同，因此其产生抗药性的速度和水平也会不同。系统监测我国不同地区草地贪夜蛾的抗药性对于因地制宜制订抗性治理策略就显得尤为重要(李永平等, 2019; 吴益东等, 2019)。害虫对杀虫剂的敏感基线是评价其抗药性水平的重要依据，在抗药性监测以及治理中具有重要意义。如棉铃虫Helicoverpaarmigera(陈长琨等, 2000)、麦长管蚜Sitobionavenae(鲁艳辉等, 2009)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(李秀环等, 2012)及稻纵卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis(王世玉等, 2016)等重要害虫对杀虫剂敏感基线的建立，使得对这些害虫抗药性的长期监测和科学防控成为可能。与其他害虫一样，草地贪夜蛾理论上可以对任何用于其防治的杀虫剂产生抗性。Zhang等(2021)对云南等4个省份的5个草地贪夜蛾种群抗药性测定发现，除双酰胺类外，所有种群都对有机磷类、噁二嗪和拟除虫菊酯类杀虫剂产生了高水平抗性。但由于缺乏敏感基线，对草地贪夜蛾的抗药性监测无法正常进行。因此，本文建立了草地贪夜蛾对常用杀虫剂的敏感基线，对于系统监测其抗药性、指导合理用药以及评价抗药性治理措施的有效性都具有重要意义。