低温对麦红吸浆虫滞育解除及蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90表达水平的影响

张国军, 王 稳, 南江磊, 成卫宁,*, 朱克岩

(1. 西北农林科技大学植物保护学院, 陕西杨凌 712100; 2. Department of Entomology, Texas A&M University, Texas 77843, USA)

滞育是由昆虫遗传决定的对不良环境的适应机制，也是昆虫生活史保持与季节同步的一种手段(Denlinger, 2002)。昆虫一旦进入滞育，恢复发育需要一定的时间，时间长度与滞育期经历的环境条件有关。典型的滞育进程包括滞育启动、维持、终止、滞育后静息及发育等一系列动态的连续阶段(Koštál, 2006)，每个阶段均受一个或多个因子的影响。研究发现，低温是大多数滞育昆虫滞育解除最常见和主要的因子(Sgolastraetal., 2010; Dongetal., 2013; Denlinger and Armbruster, 2014; Togashi, 2019)；光周期在一些昆虫滞育解除中也起一定作用(Koštál and Hodek, 1997; Xiaoetal., 2006; Wangetal., 2009)。研究环境因子对昆虫滞育解除的影响对深入理解滞育生物学以及对滞育昆虫室内饲养也具有重要意义。

昆虫滞育不仅受环境影响，更重要的是受激素调节(Emersonetal., 2009; Chengetal., 2020)。蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)是蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)的作用靶标，是昆虫体内重要的调控蛋白。研究表明，20E在昆虫滞育解除的调控中具有重要作用，作为其受体的EcR可能也在滞育解除中发挥重要作用(Fujiwaraetal., 1995; Rinehartetal., 2001; Denlinger, 2002)。热激蛋白(heat shock protein, HSP)是机体遭受热、冷和其他许多不利因素胁迫时诱导产生的一类高度保守的蛋白质。近年来的研究发现，HSP基因的表达与环境胁迫和昆虫滞育发育密切相关，如苜蓿切叶蜂Megachilerotundata和麻蝇Sarcophagacrassipalpis的Hsp70和Hsp90(Haywardetal., 2005; Yocumetal., 2005)。

麦红吸浆虫Sitodiplosismosellana是世界小麦生产中最重要的害虫之一，同时也是典型的专性幼虫期滞育昆虫，主要以老熟幼虫在土壤中结茧滞育，滞育过程中经历夏、秋、冬季，3-4月土壤湿度较高时，幼虫破茧恢复活动，随后化蛹、羽化(王越等, 2015)，故破茧率和破茧速率通常被视作滞育终止的直接指标，但在实验条件下破茧的幼虫能否完成发育，即破茧能否准确反映低温滞育终止情况尚不清楚。前期我们以成虫羽化率和羽化速率为指标，探讨了低温在麦红吸浆虫滞育终止中的作用(Chengetal., 2017)，并研究了EcR,Hsp70和Hsp90在自然滞育进程中的表达动态(Chengetal., 2016; 刘禹含, 2019)。为明确麦红吸浆虫各滞育终止指标的关系，阐明低温滞育终止的分子机理，在前期研究的基础上，本研究测定分析了低温(4℃)对麦红吸浆虫滞育幼虫破茧率、破茧速率、化蛹率和化蛹速率的影响及低温终止滞育进程中EcR,Hsp70和Hsp90的表达水平变化，研究结果不仅有助于人们理解麦红吸浆虫的滞育解除机制，同时为人工饲养该虫、开展更为系统深入的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2018年5月小麦黄熟期，从当年麦红吸浆虫重发地陕西兴平麦田(34°24′N, 108°46′E)大量采集感虫麦穗，放入位于陕西杨凌西北农林科技大学校园的室外养虫圃(34°16′N, 108°40′E)，让老熟幼虫自然落土，结茧进入滞育。以同年9月上旬采集的结茧幼虫作为低温处理供试虫源，9-12月采集的结茧幼虫作为自然变温处理虫源。养虫圃夏季播种玉米，秋季播种小麦。

1.2 低温(4℃)处理的麦红吸浆虫滞育解除观测

9月1日从养虫圃采集含结茧幼虫的土壤，置于海尔冷柜(BC/BD-320 HK)进行4℃低温处理，分别在处理0(对照), 30, 45, 60, 75和90 d后取出部分土壤，采用淘土法(仵均祥等, 2005)收集结茧幼虫，每次收集150头，分为3组(即3个重复)，每组50头，单头放入含有1%琼脂糖且标有A1-A50, B1-B50和C1-C50的离心管中，盖好管盖(扎有小孔)后置于24±1℃，相对湿度70%±5%，光周期16L∶8D的人工气候箱(BIC-300型，上海博讯)，每天观察3次并记录幼虫的破茧数，幼虫破茧恢复发育后记录化蛹数。试验结束后(一周内无幼虫破茧或化蛹)计算不同低温处理时长下幼虫的破茧率、存活个体的化蛹率以及破茧(移入气候箱至离开茧)和化蛹(破茧至前蛹形成)所需时间。

1.3 自然变温处理的麦红吸浆虫滞育解除观测

9月1日开始，每月从养虫圃采集土壤，共6次，即0, 30, 45, 60, 75和90 d后各采集1次，淘土收集结茧幼虫，每次收集150头，分为3组，每组50头，随后的处理、观察及计算内容同1.2节。2018年9, 10, 11和12月杨凌平均气温分别为19.42, 13.31, 6.82和0.68℃，数据来自杨凌示范区气象局。

1.4 滞育解除及滞育后发育进程中麦红吸浆虫ECR, Hsp70和Hsp90基因表达水平测定

对1.2节4℃处理0-90 d的幼虫，每个时间点再至少收集80头，每20头装于2 mL冻存管，液氮速冻后-80℃保存。另外，处理90 d后的幼虫，再多收集300头，放于铺有湿润滤纸的培养皿，置于24±1℃下让其发育，收集恢复发育3, 5和7 d的活动幼虫，每20头装于2 mL冻存管，液氮速冻后-80℃保存。分别取各时期收集的幼虫20头，按照RNAiso Plus总RNA提取试剂盒(TaKaRa, 大连)说明书提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳和Nano-300型核酸测定仪(杭州奥盛仪器有限公司)检测后，以1 μg的量为模板，参照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, 大连)反转录试剂盒说明书合成cDNA第1链，-20℃保存；各时期重复3次。

根据麦红吸浆虫EcR(GenBank登录号: MN853890)、Hsp70(GenBank登录号: KJ813013)、Hsp90(GenBank登录号: KJ813012)和内参基因GAPDH(GenBank登录号: KR733066)序列设计引物(表1)。以不同处理试虫的cDNA为模板，参照SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒说明书(TaKaRa, 大连)，在QuanStudio®5实时荧光定量PCR系统(Thermo Fisher Scientific, MA)上进行PCR扩增。反应体系(20 μL): Premix Ex TaqTMII 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板1 μL, 其余为RNase-free H2O。 扩增条件： 95℃预变性30 s； 95℃变性10 s， 60℃退火1 min， 72℃延伸30 s， 共40个循环。每样品重复测定3次。以未经低温处理的幼虫为基准，采用2-ΔΔCT法(Livak and Schmittgen, 2001)计算各处理目标基因的相对表达量。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0统计软件(Chicago, IL., 美国)进行数据统计分析。各处理幼虫的破茧率和化蛹率平方根反正弦转换后数据、发育历期及基因相对表达量进行单因素方差分析(P<0.05)，Duncan氏新复极差法进行多重比较。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

2 结果

2.1 低温(4℃)与自然变温对滞育幼虫破茧率的影响

低温处理不同时间的麦红吸浆虫结茧幼虫(9月上旬)转移至24℃，破茧率存在显著差异(P<0.05)。其中，在0-60 d，随着处理时间的延长，破茧率逐渐升高，未经低温处理的幼虫(对照)破茧率为71.3%，处理45 d的破茧率增长为92%，显著高于对照(P<0.05)，60 d的达到95.3%；60-90 d的破茧率稳定在95.3%～97.3%(图1: A)。

自然低温处理不同时间的结茧幼虫，破茧率也存在显著差异(P<0.05)，且变化趋势与4℃低温相似，即随着处理时间的延长，破茧率随之升高，处理45 d的(10月15日)达到88.7%，60 d的高达94.0%；60-90 d的破茧率稳定在93.3%～95.3%之间(图1: B)。

图1 4℃低温(A)和自然变温(B)处理不同时间后的麦红吸浆虫滞育幼虫在24℃的破茧率Fig. 1 Cocoon breaking rate of the Sitodiplosis mosellana diapausing larvae after exposed to low temperature (4℃) (A)and natural temperature (B) for different time prior to pupation at 24℃图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母表示不同处理时间间差异显著(P<0.05, Duncan氏新复极差法)。Data in the figure are mean±SE, and different letters above bars show significant difference among different treatment time (P<0.05, Duncan’s multiple range test). 下图同The same for the following figures.

2.2 低温(4℃)与自然变温对滞育幼虫破茧前期的影响

低温(4℃)处理时间显著影响结茧幼虫破茧所需时间(P<0.05)。未经低温处理的幼虫(对照) 1 d内仅1头破茧，最长的破茧需要29.5 d，平均8.1 d；随着低温处理时间延长，破茧速率明显加快。低温处理30 d的幼虫，1 d内8头破茧，最长的破茧需要26.5 d，平均6.2 d，显著低于对照；低温处理45-90 d，平均破茧仅需3.6～4.0 d，处理间无显著差异(P>0.05)(图2: A, B)。

自然变温处理也明显加快结茧幼虫的破茧速率，处理30 d后，平均破茧需要5.5 d，显著低于未处理的对照(P<0.05)；处理60～90 d后，约需3.6 d，与4℃低温处理效果相似(图2: C, D)。

图2 4℃低温(A和B)和自然变温(C和D)处理不同时间后的麦红吸浆虫滞育幼虫在24℃破茧所需时间和累计破茧率Fig. 2 Time required for cocoon breaking and cumulative cocoon breaking rates of Sitodiplosis mosellana diapausing larvae afterexposed to low temperature (4℃) (A and B) and natural temperature (C and D) for different time prior to pupation at 24℃

图3 4℃低温(A)和自然变温(B)处理不同时间后的麦红吸结茧幼虫在24℃下的化蛹率Fig. 3 Pupation rates of Sitodiplosis mosellana cocooned larvae after exposed to low temperature (4℃) (A)and natural temperature (B) for different time prior to pupation at 24℃

2.3 低温(4℃)与自然变温对滞育幼虫化蛹率的影响

未经低温(4℃)处理的结茧幼虫，转移至24℃后，没有1头化蛹。4℃低温处理明显促进滞育幼虫化蛹，处理0-60 d，随着处理时间的延长化蛹率显著提高，30 d处理的化蛹率为14.7%，60 d处理的增加到91.0%(P<0.05)。处理60-90 d，化蛹率维持在91.0%～97.3%，处理间差异不显著(P>0.05)(图3: A)。

自然变温处理时间也显著影响滞育幼虫化蛹，但与4℃低温处理比较，自然变温处理30-60 d(即9月上旬到11月上旬)增加幅度较小，处理30 d(10月上旬)的化蛹率仅为9.6%，处理45 d和60 d的分别为13.5%和28.0%，处理75 d的增幅较大，为62.8%，处理90 d的显著增加到92.7%(P<0.05)(图3: B)，与4℃低温处理的效果相当。

2.4 低温(4℃)与自然变温处理对化蛹前期的影响

4℃低温(图4: A, B)和自然变温(图4: C, D)处理不同时间的幼虫，化蛹所需时间存在显著差异(P<0.05)，总体趋势是处理时间越长，化蛹速率越快，平均所需时间越短；低温和自然变温处理30 d的幼虫，平均化蛹所需时间分别为18.7 d和18.0 d；但当处理时间≥45 d后，处理间化蛹所需时间差异不显著(P>0.05)，低温和自然变温处理化蛹所需时间分别为14.1～15.3 d和13.0～15.4 d。

2.5 麦红吸浆虫EcR, Hsp70和Hsp90在低温(4℃)终止滞育及滞育后发育进程中的表达水平变化

EcR,Hsp70和Hsp90在低温(4℃)终止滞育及24℃下滞育后发育不同时间的麦红吸浆虫幼虫中的表达水平分析结果表明，3个基因在滞育发育过程中表达量差异显著(P<0.05)，且表达模式相似，即低温处理可刺激滞育幼虫3个基因的表达，其中30 d处理的表达量最高，EcR,Hsp70和Hsp90表达量分别为对照的3.55, 4.58和3.74倍；之后随着低温处理时间延长，表达量逐渐下降，其中EcR和Hsp90在处理60 d后，Hsp70在处理75 d后表达量降低到对照的水平；随后的低温处理和发育幼虫中3个基因表达水平基本维持恒定(图5)。

图4 4℃低温(A和B)和自然变温(C和D)处理不同时间后的麦红吸浆虫滞育幼虫在24℃化蛹所需时间和累计化蛹率Fig. 4 Time required for pupation and cumulative pupation rates of Sitodiplosis mosellana diapausing larvae after exposedto low temperature (4℃) (A and B) and natural temperature (C and D) for different time prior to pupation at 24℃

图5 EcR(A), Hsp70 (B)和Hsp90 (C)在低温(4℃)终止滞育及24℃下滞育后发育麦红吸浆虫幼虫中的表达水平Fig. 5 Expression levels of EcR (A), Hsp70 (B) and Hsp90 (C) in Sitodiplosis mosellana larvae during diapausetermination stimulated by low temperature (4℃), followed by developmental resumption at 24℃

3 讨论

在滞育研究中，滞育强度或滞育发育速率通常以将滞育状态的昆虫转移至解除滞育的条件后，滞育消除所需时间的长短来衡量(Tauberetal., 1986; 赖锡婷等, 2008)。本研究中，我们采用自然变温和4℃低温处理麦红吸浆虫结茧滞育幼虫(9月上旬)不同时间后转移到正常发育温度(24℃)的方法，研究了低温对其滞育解除的影响，结果发现，处理0-60 d随着低温处理时间的延长，幼虫破茧率和化蛹率逐渐升高(图1和3)，破茧和化蛹所需时间逐渐缩短(图2和4)，说明滞育强度逐渐降低，低温在滞育解除中发挥作用。纵观国内外研究发现，低温在昆虫滞育解除中的作用大致可分为两类：对一些昆虫如始红蝽Pyrrhocorisapterus(Koštáletal., 2008)和绿盲蝽Apolyguslucorμm(卓德干等, 2011)低温能促进滞育解除，但不是滞育解除的依赖因素；还有一些昆虫如果蝇Drosophilavirilis和Chymomyzacostata(Hodek and Hodková, 1988; Kostaletal., 2000)，滞育解除只能在低温下进行。本研究发现，9月上旬采集的未经低温处理的幼虫(对照)70%以上能破茧，但均不能化蛹，即不能完成发育，说明破茧率和破茧速率可反映昆虫的滞育强度，但不能独立作为滞育解除的指标；同时说明低温是吸浆虫滞育解除的依赖条件。自然变温处理30-60 d的幼虫(9-10月)化蛹率增幅明显较4℃低温处理的小，说明4℃低温对滞育解除的效果优于9-10月的自然变温。低温处理≥60 d，自然变温处理90 d(12月上旬)的幼虫，破茧率和化蛹率均超过91%，且差异不明显，破茧和化蛹所需时间达到最低且差异不明显，说明此时大部分幼虫滞育已经解除且种群内个体发育一致，只要温度升高马上可恢复发育，然而由于低温的作用处于滞育后静息期(薛芳森等, 2001)。

大量研究表明，20E在幼虫和蛹滞育解除中发挥重要作用，EcR在其信号传导中扮演主要角色(李康等, 2011; Chenetal., 2016)。我们前期研究也发现，麦红吸浆虫自然滞育解除进程中，20E滴度与EcR表达量变化趋势一致，即在最冷的12月和1月最高，显著高于滞育解除初期(9-11月)、静息期后期(2月)和发育恢复期(3月)(成卫宁等, 2009; 刘禹含, 2019)。这表明冬季低温和光周期等环境因子对脑神经细胞的刺激作用较强，促使其分泌较多的促前胸腺激素，最终使前胸腺分泌20E的量较多，EcR响应并传导20E信号在滞育解除中发挥作用。与此相同，4℃低温处理显著促进EcR表达(图5: A)，尤其30 d处理，不同的是EcR表达水平随着滞育强度的降低而下降，说明低温对EcR表达的刺激作用强于自然解除滞育前期(9-11月)的变温，尽管表达水平下降，相对短的时间累积(60 d)也足以促进滞育解除。

众所周知，Hsp属于胁迫诱导蛋白，在昆虫对热冷、干旱等环境适应中起着分子伴侣、增强抗逆能力等重要作用(Minami and Minami, 1999; Chenetal., 2005; Shilovaetal., 2018; Baietal., 2021)。也有研究表明，Hsp90和Hsp70参与昆虫的正常发育和滞育过程，通过20E调控或者与EcR相互作用传导20E信号发挥作用(Arbeitman and Hogness, 2000; Gilbertetal., 2000; Zhengetal., 2010)。我们的研究发现，无论在自然变温解除滞育(Chengetal., 2016)还是4℃低温解除滞育进程中，麦红吸浆虫Hsp70和Hsp90表达量(图5: B和C)与20E滴度和EcR表达量变化基本一致，说明Hsp70和Hsp90在冬季耐寒性和滞育解除中发挥作用，但以何种方式参与滞育解除的调控，尚需通过进一步实验(如20E处理、pull-down或免疫共沉淀)来明确。

综上所述，低温处理能显著促进麦红吸浆虫的滞育解除，4℃低温对滞育解除的效果优于9-10月自然变温，与11-12月变温相当；破茧率和破茧速率可作为评判结茧幼虫滞育强度的参考，但不能独立作为滞育解除的指标；麦红吸浆虫EcR,Hsp70和Hsp90基因的表达水平与低温解除滞育进程相关，推测表达受20E调控或通过参与20E信号传导在滞育解除中发挥作用。研究结果不仅为深入理解麦红吸浆虫滞育解除的分子机理，同时为提高室内饲养技术、开展更为系统深入的研究奠定了良好基础。