草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因的克隆、时空表达谱及对温度胁迫的响应

梁玉键, 张 涛, 李 草, 郅军锐

(贵州大学昆虫研究所, 贵州省山地农业病虫害重点实验室, 贵阳 550025)

海藻糖(trehalose)是由两分子葡萄糖以α,α-1,1-糖苷键构成的一种非还原性双糖，广泛分布于昆虫的各种组织和器官中(Elbeinetal., 2003)，其含量会随昆虫的生长发育、生命活动及外界环境的变化而发生适应性调节(Thompson, 2003)。海藻糖不仅作为一种贮存性的能源物质，为昆虫的生长发育和各项生命活动提供能量(于彩虹等, 2008)，而且具有特殊的分子结构，对多种生物活性物质具有非特异性的保护作用，是生物体内一种高效的抗逆应激代谢产物(Tsonevetal., 1994; Wang and Haymet, 1998; Chenetal., 2002; Thompson, 2003)。此外，海藻糖代谢还对昆虫蜕皮过程中几丁质的合成和降解具有调控作用(Yangetal., 2017; 唐斌等, 2018; Yuetal., 2021)。因此，海藻糖被认为是昆虫体内最重要的一类双糖，被称为昆虫的“血糖”(于彩虹等, 2008)。昆虫在海藻糖-6-磷酸合成酶/6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate synthase/trehalose-6-phosphate phosphatase, TPS/TPP)的共同作用下合成海藻糖(Tangetal., 2018)。TPS首先将尿苷二磷酸葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸催化合成6-磷酸海藻糖；然后6-磷酸海藻糖在TPP的作用下去磷酸化生成海藻糖(Giaeveretal., 1988)。如在葱蝇Deliaantiqua(Guoetal., 2015)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Tangetal., 2010)等多种昆虫中发现海藻糖的含量变化与TPS的表达和TPS酶活性变化存在一致性，证明了TPS是昆虫体内海藻糖合成的重要调控因子。虽然昆虫体内海藻糖的合成需要TPS/TPP两类酶的共同参与，但是目前只在葱蝇(Guoetal., 2015)、沙葱萤叶甲Galerucadaurica(路标, 2018)、嗜眠摇蚊Polypedilumvanderplanki(Mitsumasuetal., 2010)等少数昆虫中同时克隆得到TPS和TPP两种调控海藻糖合成的基因。在大多数昆虫中均只克隆得到TPS一种基因，但这些昆虫体内TPS所编码的氨基酸序列通常包含TPS和TPP两个功能结构域(Guoetal., 2015; 唐斌等, 2019)，因此有学者推测一些昆虫中可能只存在TPS一种调控海藻糖合成的基因(Tangetal., 2018)。据不完全统计，已经从黑腹果蝇Drosophilamelanogaster(Chenetal., 2002)、棉铃虫Helicoverpaarmigera(Xuetal., 2008)、甜菜夜蛾(Tangetal., 2010)、褐飞虱Nilaparvatalugens(唐斌等, 2019)和赤拟谷盗Triboliumcastaneum(Chenetal., 2018)等近40多种昆虫中克隆得到TPS。并且在褐飞虱、赤拟谷盗等少数昆虫中发现了多个不同的TPS，这些不同的TPS在系统进化和三级结构上均存在较大的差异(唐斌等, 2019)。由此可见，不同昆虫体内海藻糖的合成存在不同的分子调控机制，同种昆虫体内海藻糖的合成也是一个复杂的分子调控过程。

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾属Spodoptera，是一种原产于美洲热带和亚热带的害虫，具有极强的迁飞和危害能力(Goergenetal., 2016)，草地贪夜蛾对极端温度具有极强的适应能力。鉴于海藻糖特殊的分子功能，其极有可能是草地贪夜蛾抵御温度胁迫的重要因子之一。目前，关于草地贪夜蛾体内海藻糖合成的分子机制，以及TPS在草地贪夜蛾生长发育过程和抵御温度胁迫中是否具有重要的调控作用还不清楚。因此，本研究以草地贪夜蛾为对象，运用分子生物学技术，克隆和鉴定草地贪夜蛾TPS，并测定TPS在草地贪夜蛾不同发育阶段、5龄幼虫不同组织和极端温度胁迫下的表达变化，旨在初步明确TPS在草地贪夜蛾生长发育过程中的重要作用，以及应对极端温度胁迫时的响应机制，为进一步研究草地贪夜蛾体内海藻糖代谢的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源及处理

草地贪夜蛾幼虫于2019年5月从贵州省贵阳市花溪区天鹅村的玉米植株上采集，然后放置在实验室RXZ型多段编程人工气候箱(宁波江南仪器厂，温度25±1℃，相对湿度70%±5%，光周期14L∶10D)保种。幼虫用人工饲料进行饲养，饲料配方参照李子园等(2019)饲料配方Ⅱ并稍作改进，配方组成成分为：蒸馏水1 200 mL，黄豆粉120 g，麦麸粉120 g，酵母粉48 g，干酪素24 g，琼脂24 g，山梨酸2.4 g，胆固醇0.24 g，肌醇0.24 g，抗坏血酸9.6 g，氯化胆碱1.2 g。成虫用10%的蜂蜜水饲养。根据草地贪夜蛾不同发育阶段或龄期的蜕皮和发育时间，每个发育阶段或龄期取前、中、后3个时间段的样品，即：卵期(前期：卵期4 h；中期：卵期24 h；后期：卵期48 h)、1龄幼虫(前期：4 h；中期：24 h；后期：36 h)、2-5龄幼虫(前期：4 h；中期：12 h；后期：24 h)、6龄幼虫(前期：4 h；中期：24 h；后期：72 h)、蛹(前期：4 h；中期：72 h；后期：120 h)、成虫(前期：4 h；中期：72 h；后期：120 h)共27个处理。每个处理设3个生物学重复(下同)，其中卵200粒左右为一个生物学重复；1-2龄幼虫30头为一个生物学重复；3龄幼虫10头为一个生物学重复；4-6龄幼虫、蛹和成虫均为5头虫为一个生物学重复。取草地贪夜蛾5龄第1天幼虫于冰上解剖获得体壁、中肠、脂肪体等组织。每个生物学重复共解剖15头幼虫以保证样品量充足，样品经液氮速冻后置于-80℃冰箱待用。根据草地贪夜蛾生物学习性，本实验共设10℃和35℃两个温度处理，将饲养在温度25±1℃的草地贪夜蛾5龄第1天幼虫分别放置到温度为10℃和35℃(其他饲养条件与25℃正常饲养相同)的人工气候箱内分别胁迫2, 4和8 h，以正常(25℃)饲养2, 4和8 h的草地贪夜蛾5龄第1天幼虫为对照。每个生物学重复取5头草地贪夜蛾5龄第1天幼虫。样品经液氮速冻后置于-80℃冰箱待用。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

取出1.1节中各处理样品，使用Eastep®Super Total RNA Extraction Kit试剂盒(上海普洛麦格生物有限公司)提取样品的总RNA，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，运用分光光度计(Nano PhotometerTMP-Class)检测RNA的浓度和纯度。分别取2 μL各样品的总RNA模板，按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)合成cDNA，将总RNA和cDNA模板分别置于-80℃和-20℃保存备用。

1.3 草地贪夜蛾TPS克隆

在NCBI中搜索获得草地贪夜蛾TPS的转录组数据及其他昆虫中已知的TPS数据，运用DNAMAN 7.0进行比对，筛选昆虫中TPS的保守区域，运用Primer Premier 6.0设计引物P-TPS1(表1)。以1.2节中草地贪夜蛾2龄幼虫总RNA反转录获得的cDNA为模板，PCR扩增草地贪夜蛾TPS的目的片段。总反应体系(25 μL): Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)12.5 μL, cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 8.5 μL。反应程序: 95℃预变性3 min; 95℃变性30 s, 54℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。反应完成后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检测到目的条带后，用柱式PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)对PCR产物进行纯化回收，将纯化后的目的片段连接至5×pClone007 Versatile Simple Vector Mix(北京擎科生物技术有限公司)载体并转化入大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞，涂平板，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，将检测到目的片段的菌落接种于2 mL的含Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。最后将扩大培养的菌液送至上海生工生物有限公司测序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

在获得第1段草地贪夜蛾TPS的目的片段后，继续设计引物P-TPS2(退火温度55℃)和P-TPS3(退火温度53℃)(表1)，经PCR反应、连接转化入大肠杆菌，送公司测序后获得草地贪夜蛾TPS的全长编码区。

1.4 草地贪夜蛾TPS序列分析

运用DNAMAN 7.0的Sequence Assembly对克隆得到的3段草地贪夜蛾TPS序列进行组装，使用NCBI的Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)工具对组装得到的TPS进行比对分析；使用NCBI数据库中的ORFfinder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)预测草地贪夜蛾TPS的开放阅读框；利用ExPASy ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白质的理化性质；应用SignalP-5.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽；蛋白跨膜结构预测使用TMHMM Server 2.0((https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)；使用NetNGlyc-1.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)和NetOGlyc-4.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)预测N-糖基化位点和O-糖基化位点；运用NCBI数据库中的Conserved Domains工具分析蛋白质的保守结构域；以草地贪夜蛾TPS序列为询问序列，在GenBank中搜索鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目、直翅目共17种昆虫的TPS序列，应用DNAMAN进行氨基酸序列的同源性比对；以中国对虾Fenneropenaeuschinensis的TPS(GenBank登录号: ACD74843.1)为外群，用MEGA6.0软件中的邻接(neighbor-joining)法重复运行1 000次构建系统发育树；利用在线分析软件SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html)预测蛋白质的二级结构；使用Biozentrum SWISS-MODEL预测蛋白质的三级结构(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)，并用PlyMOL 1.1软件进行3D建模。

1.5 草地贪夜蛾TPS的表达分析

以1.2节中样品的cDNA第1链为模板，以草地贪夜蛾核糖体蛋白L27(ribosomal protein L27，RPL27)基因(GenBank登录号: AF400191.1)为内参基因，引物为Q-RPL27(扩增效率为98.43%)(Karamipouretal., 2018)；用草地贪夜蛾TPS的编码区设计用于RT-qPCR的特异性引物Q-TPS(扩增效率为100.90%)(表1)。运用FastStart Essential DNA Green Master(Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)进行荧光定量。总反应体系(20 μL): cDNA模板2 μL, ddH2O 6 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, FastStart Essential DNA Green Master 10 μL。反应程序: 95℃预变性10 min; 95℃变性30 s, 56℃退火30 s, 40个循环; 65℃ 5 s, 95℃ 5 s。

1.6 数据分析

采用2-ΔΔCt法计算草地贪夜蛾TPS的相对表达量(Livak and Schmittgen, 2001)，运用Microsoft Excel 2019和SPSS 23.0对数据进行统计和分析；不同温度胁迫下，草地贪夜蛾TPS相对表达量的差异显著性用单因素方差分析Turkey氏法，运用Origin 2018作图。

2 结果

2.1 草地贪夜蛾SfTPS的克隆及序列特征

克隆获得草地贪夜蛾TPS的cDNA全长序列2 571 bp，命名为SfTPS(GenBank登录号: MT920672)，开放阅读框(ORF)长2 481 bp，编码826个氨基酸。预测蛋白质分子量为92.70 kD，等电点(pI)为6.45，分子式为：C4130H6504N1144O1200S41，推测半衰期为30 h，失稳系数为41.49，是一种不稳定蛋白质。总平均亲水性指数为-0.265，为亲水性蛋白质。无信号肽，无跨膜结构域。预测SfTPS具有N-糖基化位点3个，O-糖基化位点18个。蛋白结构域分析表明，SfTPS具有TPS和TPP两个保守的功能结构域，其中TPS结构域定位在第18-494位氨基酸(E=0e+00)，TPP结构域定位在第532-763位氨基酸(E=2.12e-63)，分别对应酵母的OtsA和OtsB。在草地贪夜蛾SfTPS的二级结构中，α-螺旋(α-helix)，β-折叠(β-sheet)和无规则卷曲(random coil)的占比分别为38.14%, 12.23%和48.55%。基于5hut.1.A进行草地贪夜蛾SfTPS的3D建模，结果表明，草地贪夜蛾SfTPS的建模残基(modelled residue range)范围为17-499，序列同源性(sequence identity)为37.85%，用PyMOL构建的草地贪夜蛾SfTPS的三级结构为同源二聚体(homo-dimer)，由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲连接而成(图1)。

图1 草地贪夜蛾SfTPS的三级结构预测Fig. 1 Predicted 3D structure of SfTPSof Spodoptera frugiperda红色表示α-螺旋，黄色表示β-折叠，绿色表示无规卷曲。The red represents α-helix, the yellow represents β-sheet, and the green represents random coil.

2.2 草地贪夜蛾SfTPS同源性比对及系统进化

氨基酸序列比对分析结果表明，草地贪夜蛾TPS与斜纹夜蛾SpodopteralituraTPS(GenBank登录号: ADA63844.1)的序列一致性最高，为99.15%；与黑腹果蝇TPS (GenBank登录号: NP608827.1)的序列一致性最低，为72.58%；与甜菜夜蛾TPS(GenBank登录号: ABM66814.2)、棉铃虫TPS(GenBank登录号: ACH88521.1)、东亚飞蝗LocustamigratoriamanilensisTPS(GenBank登录号: ABV44614.1)和褐飞虱TPS(GenBank登录号: ACV20871.1)的序列一致性分别为98.79%, 97.22%, 78.32%和74.06%(图2)。

系统发育树表明(图3)，昆虫纲的17种昆虫和甲壳纲十足目的中国对虾形成了两个大分支；其中，鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目和直翅目各目的昆虫分别聚为一支。在鳞翅目中，SfTPS与斜纹夜蛾TPS的亲缘关系最近，置信度为70%，与甜菜夜蛾、棉铃虫等鳞翅目昆虫的亲缘关系较近，与豆野螟Marucavitrata的亲缘关系最远。由此可见，昆虫的海藻糖合成酶TPS具有较高的保守性，其系统进化关系符合昆虫传统分类体系。

2.3 草地贪夜蛾SfTPS的时空表达谱

以草地贪夜蛾1龄幼虫4 hSfTPS的mRNA表达量为基准，分析SfTPS在草地贪夜蛾不同发育阶段的表达情况。结果表明，SfTPS在草地贪夜蛾整个发育阶段均有表达(图4: A)，SfTPS在卵期和1-5龄幼虫期的表达量相对较低，除2龄幼虫4 h外，其他时段SfTPS的表达量均低于标准参量。在6龄幼虫期、蛹期和成虫期SfTPS的表达量相对较高，除成虫4 h外，其他时段SfTPS的表达量均高于标准参量。其中SfTPS在成虫72 h的相对表达量最高，为标准参量的6.01倍；5龄幼虫12 h表达量最低，只有标准参量的0.04倍。当草地贪夜蛾发育至6龄幼虫后，SfTPS的表达量明显升高。蛹期4, 72和120 h草地贪夜蛾SfTPS的表达量呈下降趋势；成虫期4, 72和120 h草地贪夜蛾SfTPS的表达量呈先上升后下降的趋势。此外，草地贪夜蛾SfTPS的相对表达量在卵到1龄幼虫4 h、6龄幼虫72 h到蛹4 h、蛹72 h到成虫4 h等变态前后的变化较大。

图2 草地贪夜蛾与其他昆虫TPS蛋白多序列比对Fig. 2 Multiple sequence alignment of TPS proteins of Spodoptera frugiperda and other insectsTPS蛋白来源物种及GenBank登录号Origin species of TPS proteins and their GenBank accession numbers: SfTPS: 草地贪夜蛾S. frugiperda, MT920672; SlTPS: 斜纹夜蛾S. litura, DA63844.1; SeTPS: 甜菜夜蛾S. exigua, ABM66814.2; HaTPS: 棉铃虫Helicoverpa armigera, ACH88521.1; NlTPS: 褐飞虱Nilaparvata lugens, ACV20871.1; DmTPS: 黑腹果蝇Drosophila melanogaster, NP608827.1; LmTPS: 东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis, ABV44614.1.

图3 邻接法构建的基于氨基酸序列的草地贪夜蛾与其他物种TPS蛋白的系统发育树(1 000次重复)Fig. 3 Phylogenetic tree of TPS proteins of Spodoptera frugiperda and other species based on the amino acidsequence constructed by the neighbor-joining method (1 000 repetitions)节点处的数值代表重复1 000 次的bootstrap 值。Numbers at nodes represent bootstrap values by 1 000 repeats.

SfTPS的组织分布结果表明，SfTPS在草地贪夜蛾5龄幼虫脂肪体中高表达，在中肠和体壁中低表达。SfTPS在脂肪体中的表达量是体壁中(标准参量)的9.87倍，在中肠中的表达量只有标准参量的0.53倍(图4: B)。

图4 草地贪夜蛾SfTPS不同发育阶段(A)和5龄幼虫不同组织中(B)表达水平Fig. 4 Relative expression levels of SfTPS in different developmental stages (A) and different tissuesof the 5th instar larvae (B) of Spodoptera frugiperdaE: 卵 Egg; 1L-6L: 分别为1-6龄幼虫1st-6th instar larva, respectively; P: 蛹Pupa; Ad: 成虫Adult. I: 体壁Integument; M: 中肠Midgut; F:脂肪体Fat body. 时间为对应发育阶段下的发育时间。图中数据为平均值±标准误。The time is the development time during the corresponding developmental stages. Data in the figure are mean±SE.

2.4 短期高低温胁迫后草地贪夜蛾SfTPS的表达水平

在10和35℃的极端温度胁迫下草地贪夜蛾体内SfTPS的相对表达量显著高于对照(25℃)(P<0.05)，其中，10℃低温胁迫后，SfTPS的相对表达量是对照的4.43～9.34倍，而35℃高温胁迫后SfTPS的相对表达量是对照的2.50～6.03倍(图5)。在10℃低温处理下，随着处理时间的延长草地贪夜蛾SfTPS的表达量呈先上升后下降，SfTPS的相对表达量在胁迫4 h后达到最高，胁迫8 h后显著降低(P<0.05)；在35℃高温处理下，经8 h处理后SfTPS的相对表达量显著高于处理2 h和4 h时的(P<0.05)。

图5 短期温度胁迫后草地贪夜蛾5龄幼虫中SfTPS的相对表达量Fig. 5 Relative expression levels of SfTPS inthe 5th instar larvae of Spodoptera frugiperdaunder short-term temperature stress图中数据为平均值±标准误；柱上不同小写字母和大写字母分别表示同一温度不同时间处理间和同一时间不同温度处理间基因表达水平存在显著差异(P<0.05, Turkey氏法)。Data in the figure are mean±SE. Different lowercase and capital letters above bars indicate that there are significant differences in the gene expression level among different exposure time at the same temperature and among different temperature treatments at the same time (P<0.05, Turkey’s test), respectively.

3 讨论

昆虫的TPS基因具有较高的保守性，其编码的氨基酸序列一般在750～850个氨基酸之间，无信号肽和跨膜结构域，通常存在TPS和TPP两个保守结构域(Xuetal., 2008; Tangetal., 2010; 秦资等, 2012; 路标等, 2017)。本研究克隆获得草地贪夜蛾SfTPS的cDNA序列2 571 bp，其开放阅读框长2 481 bp，编码826个氨基酸，无信号肽和跨膜结构域，其编码氨基酸存在TPS(第18-494位氨基酸)和TPP(第532-763位氨基酸)两个保守结构域，与酵母OtsA和OtsB两个海藻糖合成途径的关键酶相对应。分析发现，SfTPS与鳞翅目昆虫TPS的亲缘关系最近，与昆虫纲其他昆虫的亲缘关系较远。在三级结构上，SfTPS与褐飞虱的TPS1(唐斌等, 2019)较为相似，推测SfTPS与褐飞虱TPS1的功能可能存在相似性。综上所述，草地贪夜蛾SfTPS属于昆虫的TPS家族。

本研究发现SfTPS在草地贪夜蛾不同发育阶段和5龄幼虫不同组织中的表达特性，其中SfTPS在6龄幼虫期、蛹期和成虫期高表达(图4: A)，表明草地贪夜蛾在这些时期会大量积累海藻糖，Wyatt(1967)也发现昆虫蛹期海藻糖的含量通常高于其他发育阶段。一方面，合成的海藻糖被用于提供昆虫静止期所需的能量(于彩虹等, 2008)。另一方面，海藻糖还能作为抗逆应激的代谢产物，提高昆虫静止期的抗逆能力。张悦等(2020)发现草地贪夜蛾蛹期的过冷却点和结冰点会明显低于其他发育阶段，这种抗寒能力的提升极有可能与其蛹期的海藻糖含量较高有关。草地贪夜蛾作为一种典型的迁飞性害虫(Westbrooketal., 2019)，其迁飞时需要消耗大量能量，而海藻糖是昆虫飞行时的能量来源之一(Geetal., 2011; Zhaoetal., 2011)。葛世帅等(2019)研究发现，草地贪夜蛾3日龄成虫的飞行能力最强，3日龄后草地贪夜蛾成虫的飞行能力逐渐减弱，推测草地贪夜蛾的迁飞发生在卵巢稚嫩期(3日龄以前)。SfTPS的表达量在草地贪夜蛾成虫72 h时达到整个发育阶段的最高水平(图4： A)，这种高表达极有可能与草地贪夜蛾的迁飞活动相关。另外SfTPS的相对表达量在卵到幼虫、幼虫到蛹、蛹到成虫等变态前后的变化较大(图4: A)，推测SfTPS还与草地贪夜蛾的变态蜕皮等生理功能相关。TPS对几丁质代谢具有调控作用已在褐飞虱、白背飞虱等昆虫中得到证实(Yangetal., 2017; 张道伟等, 2019)。本研究还发现SfTPS在5龄幼虫脂肪体中表达丰度最高(图4: B)，推测草地贪夜蛾的海藻糖主要在脂肪体中合成，这一研究结果与海藻糖在昆虫脂肪体中合成的理论相符(Thompson, 2003; Tangetal., 2010; 唐斌等, 2014)。目前，化学防治还是草地贪夜蛾应急防控的主要手段，但由于农药使用不合理，草地贪夜蛾已对多种现有农药产生了抗药性(Carvalhoetal., 2013; Bolzanetal., 2019)，因此，亟需寻找草地贪夜蛾体内安全有效的农药作用靶标。SfTPS是调控草地贪夜蛾体内海藻糖合成的关键基因，在草地贪夜蛾能量供给、几丁质合成及抗逆等方面均发挥着重要作用，是一种具有研究前景的农药潜在靶标。

昆虫是典型的变温动物，其生命活动极易受到环境温度的影响(张红梅等, 2020)。草地贪夜蛾无滞育现象，每年均会北迁南回以躲避温度变化和食料缺乏等不良环境(Sparks, 1979; 陈辉等, 2020)。姜玉英等(2021)调查发现，草地贪夜蛾能在夏季30℃以上的高温地区(海南、台湾、广州)发生危害，而冬季能在1月平均温度10℃等温线以南的地区(云南、广东、海南、四川、广西、福建、贵州)越冬繁殖。草地贪夜蛾经短期高低温胁迫后，其SfTPS的mRNA表达显著高于对照(P<0.05)(图5)，推测是草地贪夜蛾响应极端温度胁迫的一种抗逆机制。多位学者研究发现沙葱萤叶甲(路标等, 2017)、异色瓢虫Harmoniaaxyridis(秦资等, 2012)、德国小蠊Blattellagermanica(陈静和张道伟, 2015)等昆虫经不同温度胁迫后，其体内TPS的mRNA表达量也明显升高。本研究还发现在10℃处理下，SfTPS的表达量在4 h后就达到峰值；但在35℃下经4 h处理后SfTPS的表达量还在升高，其表达量在8 h处理下最高(图5)。而且低温处理后SfTPS表达是对照的4.43～9.34倍，而高温处理后SfTPS表达才达到对照的2.50～6.03倍(图5)，预测SfTPS在响应低温胁迫中发挥的作用比在响应高温胁迫中更强。结合本研究结果，推测越冬越夏期间草地贪夜蛾体内的海藻糖含量可能显著高于其他时期，这种生理调节能够提高草地贪夜蛾应对极端温度胁迫的能力，为草地贪夜蛾的定殖和入侵提供有利条件。本研究只测定了高低温胁迫下SfTPS的表达变化，只能间接表明海藻糖能够参与草地贪夜蛾对极端环境温度胁迫的适应。在后续的工作中，可以深入研究温度胁迫后草地贪夜蛾体内TPS活性变化和海藻糖含量变化，进一步阐明海藻糖在草地贪夜蛾适应极端环境温度胁迫中的功能。

本研究结果提示，SfTPS是草地贪夜蛾海藻糖合成途径的关键基因，对该虫的生长发育过程起重要的调控作用。然而包括人类在内的哺乳动物不能自身合成海藻糖，因此TPS具有成为安全农药靶标的潜力(Tangetal., 2018)。在后续的工作中应结合RNAi技术进一步探究SfTPS在草地贪夜蛾生长发育、抗逆应激和调控几丁质合成等方面的具体功能，为应用SfTPS作为靶基因进行草地贪夜蛾的防控奠定理论基础。