阻断CCR2信号对IgA肾病模型大鼠肾病理损伤及炎性因子表达的影响

沈雁婕，朱志清，王 蕊，闫莉莉，鹿 玲，张 琴，任振华

IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)是指肾小球系膜区以IgA沉积和系膜细胞增殖为特征的原发性肾小球肾炎。IgA1合成和糖基化异常，导致循环半乳糖缺陷型IgA1增加失调。异常糖基化的IgA1与特定的自身抗体形成免疫复合物，沉积在肾小球引起其系膜细胞增殖[1]。同时，免疫复合物诱导增殖的系膜细胞释放炎症因子和趋化因子，促进肾脏组织炎症反应，进一步导致肾脏间质纤维化[2]。目前，IgAN的具体发病机制尚不清楚，临床以保守治疗和皮质类固醇药物治疗为主[3]，但药物毒副作用较大且疗效不显著。因此，明确IgAN的发病机制，寻找新的治疗方法显得尤为迫切。C-C趋化因子受体2(C-C chemokine receptor 2, CCR2)信号通路被认为与多种肾病相关[4-5]，但MCP-1/CCR2在IgAN中的作用尚不清楚。奥美沙坦是一类血管紧张素II受体拮抗剂，常用于IgAN治疗[6-7]。本实验着重探讨CCR2在IgAN模型大鼠肾组织中的表达及与肾脏病理的关系，分析CCR2信号通路在IgAN发生、发展中的作用，为临床治疗IgAN提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂兔抗大鼠CCR2抗体购自BioVision公司；CCR2阻滞剂RS102895购自Tocris Bioscience公司；炎症因子IL-6、IL-17和TNF-α抗体及趋化因子MCP-1抗体和山羊抗大鼠IgA抗体，均购自Abcam公司。二抗、DAB显色试剂盒等，均购自北京中杉金桥公司。奥美沙坦购自国药集团；ECL增强化学发光试剂盒、牛血清白蛋白、脂多糖、二硫苏糖醇等，均购自美国Sigma公司。逆转录酶、DNA聚合酶等，购自Promega公司；造模用蓖麻油和四氯化碳，均购自天津光复化工公司。

1.2 实验动物及分组Wistar大鼠48只(6周龄)，雄性，每只质量(150±10)g，购自安徽医科大学实验动物中心。Wistar大鼠随机分成正常对照组(14只)和IgAN模型组(34只)。参照汤颖等[8]的造模方法建立IgAN模型，首先用BSA(100 g/L)每隔1天给大鼠灌胃(4 mL/kg)，合计8周；皮下注射0.3 mL蓖麻油和0.1 mL四氯化碳，每周1次，合计注射9次；第6和第8周的第一日尾静脉注射0.05 mg脂多糖，对照组采用等量氯化钠溶液。第7和第12周末取2只对照组及IgAN模型组大鼠，取肾脏皮质以备荧光染色和病理染色。造模完成后，将30只IgAN模型大鼠随机分成IgAN模型组、CCR2拮抗剂组和奥美沙坦组，每组10只。CCR2拮抗剂组大鼠RS102895(10 mg/kg)灌胃，奥美沙坦组以Olmesartan(10 mg/kg)灌胃，IgAN模型组以同等剂量生理盐水代替，1天1次，持续2周，第14周末处死大鼠，取肾皮质备用。

1.3 方法

1.3.1血液和尿液标本检测 收集各组大鼠尿液和血液样本，在第7、9、12、14周末收集24 h尿液，在第12周末和第14周末采集血液样本。生化分析仪测定24 h尿蛋白(NPr)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCre)和血尿酸(UA)，各组样本分3次检测，取平均值统计比较。

1.3.2肾组织切片及染色 处死动物，取肾皮质组织块，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。标本行HE、PAS、PASM和Masson染色，观察肾脏组织病理改变及肾小球系膜细胞增生。切片常规脱蜡至水，分别行IgA荧光染色和DAB染色。荧光染色一抗采用山羊抗大鼠IgA过夜，二抗为FITC标记兔抗山羊IgG；DAB染色采用3%H2O2室温30 min，5%BSA室温封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，室温复温1 h。洗涤后，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，DAB工作液显色，苏木精复染，封固后显微镜观察拍片。阴性对照以PBS代替一抗染色。

1.3.3Western blot法 肾脏组织称重加入裂解缓冲液，4 ℃震荡破碎，低温离心30 min取上清。测定蛋白浓度，煮沸蛋白，-80 ℃分装保存。30 μL蛋白样品电泳，PVDF膜电转，5%BSA或5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，TPBS洗膜3次，每次5 min，HRP标记的二抗IgG室温孵育1 h，ECL化学发光试剂盒显色，Bio-rad凝胶成像系统拍摄。

2 结果

2.1 各组大鼠肾功能损伤表现实验过程中IgAN模型大鼠出现不同程度的精神不振，食欲下降。造模第7周大鼠出现NPr，并呈进行性加重。造模第8周，大鼠出现镜下血尿。造模第14周末，IgAN模型组大鼠24 h NPr、SCre、BUN水平明显升高(P<0.01，图1)。与IgAN模型组相比，CCR2拮抗剂组和奥美沙坦组处理后，24 h Npr、BUN和SCre水平明显下降(P<0.01)，UA水平未见明显变化。

图1 各组大鼠尿液和血液样本检测：A.24 h尿蛋白；B.血肌酐；C.血尿素氮；D.血尿酸；**P<0.01,##P<0.01

2.2 各组大鼠肾脏病理学改变第14周末IgA免疫荧光结果显示，IgAN模型大鼠肾小球系膜区IgA沉积，强度为IgA(～)，CCR2拮抗剂RS102895能明显缓解IgAN模型大鼠肾小球系膜区IgA沉积。HE、Masson、PASM和PAS染色结果显示，与正常对照组相比，IgAN模型组大鼠肾组织可见肾小球肿胀，体积增大，系膜区细胞及基质增生，基膜空泡变性。与IgAN模型组相比，CCR2拮抗剂组和奥美沙坦组能明显缓解大鼠肾小球系膜细胞和基质增生(图2)。

正常对照组IgAN模型组CCR2拮抗剂组奥美沙坦组IgAHEPASPASMMasson

2.3 各组大鼠肾组织炎症因子的表达正常对照组和IgAN模型组大鼠肾组织均表达CCR2，以肾小管的表达最为强烈(图3A)。与正常对照组相比，IgAN模型组大鼠与CCR2拮抗剂组大鼠的肾脏组织CCR2的表达明显增强(P<0.05)，以CCR2拮抗剂组更为明显，而奥美沙坦组CCR2表达降低(P<0.05，图3B)。Western blot法结果亦证实，与正常对照组相比，IgAN模型组与CCR2拮抗剂组大鼠肾脏组织CCR2表达明显增强(P<0.05，图3C、D)。

图3 大鼠肾组织中CCR2表达检测：A.各组大鼠肾组织中CCR2的表达，PV两步法；B.免疫组化OD值分析；C.Western blot法检测各组大鼠肾组织中CCR2表达；D.Western blot法检测CCR2表达的定量分析：*P<0.05,**P<0.01,#P<0.05,##P<0.01

正常对照组大鼠肾小球基本无MCP-1阳性信号，IgAN模型组大鼠肾小球仅有少量MCP-1阳性细胞，MCP-1阳性信号主要集中于肾小管。与正常对照组相比，IgAN模型组大鼠肾组织中MCP-1阳性信号明显增强(P<0.05)，而CCR2拮抗剂和奥美沙坦处理后能明显降低MCP-1的表达(P<0.05，图4)。

图4 大鼠肾组织中MCP-1、IL-17、IL-6和TNF-α表达检测：A.各组肾组织中标志物的表达，PV两步法；B.各组免疫组化OD值分析：*P<0.05,**P<0.01,#P<0.05,##P<0.01

正常对照组大鼠肾组织中有少量IL-6和IL-17表达，主要集中于集合管。与对照组相比，IgAN模型组大鼠肾组织中IL-6和IL-17阳性信号明显增加(P<0.01)，IL-6阳性信号主要集中于肾小球和集合管，而IL-17阳性信号主要集中于肾小球和肾小管。CCR2拮抗剂和奥美沙坦能降低模型大鼠肾组织中IL-6和IL-17的表达(P<0.05，图4A)。

正常对照组肾组织仅少量表达TNF-α，IgAN模型大鼠肾组织中TNF-α阳性信号明显增加(P<0.05)，阳性信号主要集中于肾小球和集合管。CCR2拮抗剂和奥美沙坦能降低IgAN模型组肾组织的TNF-α阳性信号(P<0.05，图4B)。

3 讨论

IgAN又称Berger病，是全球范围内最常见的原发性肾小球肾炎，其病理特征是异常糖基化的IgA1复合物在肾小球系膜区沉积[4]。目前，IgAN发病机制仍不清楚，可能与感染、炎症、免疫反应等多种因素有关。IgAN临床、病理表现多样化，预后有异质性，尚无特效的治疗方法。

MCP-1属于CC亚家族，具有较强的趋化性，可以激活单核细胞/巨噬细胞，分泌多种炎症因子和纤维化因子。有文献报道IgAN患者中MCP-1水平与24 h NPr、肾小管间质损伤和血肌酐呈正相关，表明MCP-1可能与IgAN进展有关[9]。CCR2是MCP-1的受体，在炎症性疾病和自身免疫性疾病中发挥重要作用[10-11]。有研究报道，MCP-1和CCR2基因多态性可能影响IgAN的进展[4]。目前，尚未有研究报道CCR2信号通路在IgAN中的作用及机制。本实验通过建立IgAN大鼠模型，用CCR2拮抗剂干预后，对大鼠肾组织病理变化和相关临床指标进行检测，并以正常对照组、IgAN模型组和奥美沙坦组作为对照，观察CCR2在IgAN中的作用。本实验发现与正常对照组相比，IgAN模型组大鼠24 h NPr明显升高，BUN和SCre水平显著上升。用CCR2拮抗剂RS102895干预后，大鼠24 h NPr、BUN和SCre水平显著降低，提示CCR2拮抗剂对IgAN模型大鼠肾功能有改善作用。

异常糖基化的IgA1免疫复合物系膜沉积参与IgAN发生、发展，且系膜区IgA沉积物面积大小与IgAN病理组织学分级密切相关[12]。IgAN的诊断需评估肾活检标本并检测IgA符合物沉积，通常伴系膜/毛细血管内细胞增多和纤维化[13]。免疫荧光染色结果显示，IgAN组肾小球系膜区IgA沉积，荧光强度为IgA(～)。病理染色结果显示，IgAN模型大鼠肾组织中，系膜区细胞和基质增生，基膜空泡变性，提示造模成功。给予CCR2拮抗剂RS102895干预后，IgAN模型组大鼠肾小球系膜区IgA沉积明显减少，且系膜细胞和基质增生被缓解；提示CCR2拮抗剂能改善IgAN大鼠的病理学变化。

IgA1沉积于肾小球系膜区，引起肾小球系膜细胞增殖[14]，而异常增殖的系膜细胞释放各种趋化因子和炎症因子，进一步促进系膜细胞增殖，进而导致肾小球损伤[2]。免疫组化结果显示，与正常对照组相比，IgAN模型组大鼠肾组织中炎症相关因子MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-17阳性信号增强，与Zhang等[15]的结果一致。第12～14周给予CCR2拮抗剂干预后，上述炎症相关因子的阳性信号明显减弱。即CCR2拮抗剂能缓解IgAN模型组大鼠肾组织中的炎症反应。

综上所述，本实验结果显示，阻断CCR2信号途径能改善IgAN模型组大鼠的肾功能，减少系膜细胞增生和炎症反应，提示CCR2信号途径可能参与IgAN的发生、发展。为临床治疗IgAN提供新思路和理论依据，但CCR2信号通路在IgAN中的具体作用机制尚需进一步分析。