泪腺腺样囊性癌中MYB蛋白表达及分子遗传学特征分析

刘 辉，任雨洁，杨菁茹，李元朋，蔡凤梅，夏益敏，王卉芳

腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是好发于涎腺的恶性肿瘤[1]，泪腺ACC与涎腺ACC相比，临床更为罕见。泪腺ACC常可侵犯眼眶周围组织，因眼眶解剖部位的特殊性，手术常无法完整切除且易发生局部复发和远处转移，患者10年生存率约52%[2]。近年研究发现在涎腺ACC中普遍存在MYB、MYBL1和NFIB基因易位[3-7]，且MYB蛋白在ACC中过表达，具有较高的敏感性和特异性。既往研究多集中在涎腺ACC，而泪腺ACC报道较少。本文收集16例泪腺ACC和20例泪腺非ACC，采用免疫组化EnVision法和FISH法检测MYB蛋白表达及MYB基因易位，联合MYB蛋白表达和分子遗传学改变为泪腺ACC的诊断提供更多病理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2010年9月～2020年9月陕西省西安市人民医院(西安市第四医院)手术切除泪腺ACC标本16例和泪腺非ACC标本20例(包括泪腺混合瘤12例、泪腺恶性混合瘤6例、泪腺腺癌1例、泪腺腺泡细胞癌1例)。所有病例均未行放、化疗或其他针对肿瘤的治疗，由两位经验丰富的病理医师重新阅片。根据ACC组织学类型对其进行分级：Ⅰ级以管状或筛状结构为主，无实性成分；Ⅱ级为管状、筛状和实性成分均有，且实性成分≤30%；Ⅲ级为管状、筛状和实性成分均有，且实性成分>30%。收集所有病例的临床资料，随访截至2020年9月，时间为1个月～5年。

1.2 免疫组化检测及结果判定免疫组化采用EnVision法染色，兔单克隆抗体MYB(1 ∶200)购于美国Abcam公司，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。MYB阳性结果判读标准：MYB阳性定位于细胞核，呈棕黄色颗粒。(1)按阳性细胞着色程度计分：未着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；(2)按阳性细胞百分比计分：<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项评分相乘：0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为中等阳性，9～12分为强阳性。

1.3 FISH检测及结果判定FISH检测MYB基因易位：石蜡包埋组织，4 μm厚连续切片，常规脱蜡水化，晾干。杂交前处理，变性及杂交，探针为MYB(6q23)基因断裂探针(广州安必平公司)；杂交后洗涤，荧光显微镜下观察切片，4 ℃保存切片等，实验流程按试剂盒说明书进行。FISH结果判定：无MYB基因易位的细胞核中显示2个紧密相邻的红、绿信号，或有叠加的部分呈黄色；有MYB基因易位的细胞核则显示至少1对红、绿分离信号，且红、绿信号分离间距≥2个信号点直径距离。由于切面原因，会出现部分信号丢失现象，因而只计数信号完整(2红、2绿)的细胞。选取20个视野(1 000倍)，计数200个细胞核，阳性细胞核比例≥30%时为阳性；<10%时为阴性；≥10%且<30%时为不确定病例，需进行其他验证。本组未见不确定病例。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料采用n(%)表示，组间总体分布趋势比较采用χ2检验及Fisher精确概率法，组间两两比较采用Bonferrion矫正法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征16例ACC患者年龄19～74岁，平均49岁，男女比为5 ∶11，肿瘤最大径0.8～4.5 cm，平均2.6 cm。泪腺ACC患者临床表现主要为眼部肿物，部分患者伴眼睑水肿或疼痛流泪。影像学多表现为明显的眼眶内肿物，部分病例边界不清，肿瘤组织破坏周围骨组织呈侵袭性生长，其中2例伴淋巴结转移。随访时间1个月～5年，4例患者出现局部复发，随访患者均无死亡(表1)。

表1 泪腺ACC临床病理资料及免疫组化和FISH检测

2.2 病理特征泪腺ACC组织主要由导管细胞和肌上皮细胞构成，形成管状、筛状或实性结构，筛孔内可见嗜碱性黏液样物质(图1、2)，并可见神经侵犯(图3)。按病理学分级：16例泪腺ACC中Ⅰ级5例，以管状或筛状结构为主，无实性成分；Ⅱ级9例，有管状、筛状和实性成分，且实性成分≤30%；Ⅲ级2例，有管状、筛状和实性成分，且实性成分>30%(表1)。部分病例肿瘤细胞也可见条索状排列。

2.3 MYB蛋白表达免疫组化EnVision法检测MYB蛋白在泪腺ACC组织中呈细胞核阳性着色，16例泪腺ACC中强阳性5例(表1，图4、5)，中等阳性11例(图6)。泪腺ACC中MYB蛋白表达与肿瘤大小、病理分级、复发转移及患者预后均无关(P>0.05)。MYB蛋白在泪腺ACC组和非ACC组中的阳性率分别为100%(16/16)和0(0/20)，差异有显著性(P<0.01)。

2.4 MYB基因易位FISH法检测16例泪腺ACC组织中有14例标本存在MYB基因易位(表1)，表现为红绿信号分离(图7)，阳性率为87.5%(14/16)。2例患者FISH检测阴性，但MYB蛋白免疫组化检测均呈中等阳性。泪腺ACC中MYB基因易位与肿瘤大小、病理分级、复发转移及患者预后均无显著相关性(P>0.05)。20例泪腺非ACC标本中均未检测到MYB基因易位，差异有显著性(P<0.01)。

①②③④⑤⑥⑦图1 肿瘤组织呈筛状排列,腔内可见嗜碱性分泌物,可见正常泪腺组织(箭头) 图2 泪腺ACC肿瘤细胞呈实性排列图3 肿瘤细胞呈条索状排列并侵犯神经组织 图4 MYB在ACC细胞核呈强阳性,EnVision法 图5 MYB在泪腺ACC组织中呈弥漫强阳性,EnVision法 图6 MYB在泪腺ACC部分肿瘤细胞呈中等阳性,EnVision法 图7 FISH检测泪腺ACC中MYB发现基因断裂

3 讨论

MYB属于原癌基因，编码核转录因子c-MYB，文献陆续发现MYBL1(a-MYB)和MYBL2(b-MYB)，三者均为MYB转录因子家族成员。研究发现MYB在细胞增殖、分化和血管生成等方面发挥重要作用[8]，c-MYB在白血病、结肠癌、乳腺癌和肝癌中均存在过表达。目前，研究显示ACC常发生t(6；9)(q22-23；p23-24)染色体易位，MYB和NFIB发生融合，形成MYB-NFIB融合基因，参与ACC的发生、发展[3-7]。WHO(2017)头颈部肿瘤分类将t(6；9)(q22-23；p23-24)染色体易位作为涎腺ACC特征性的分子遗传学改变，在涎腺ACC诊断中具有较高的敏感性和特异性。

ACC多见于涎腺，也可发生于泪腺、乳腺、肺和皮肤等部位[9-11]。既往研究多集中在涎腺和乳腺等常见部位的ACC，泪腺和肺等少见部位ACC分子改变报道较少[3,11-14]。泪腺ACC常需与泪腺部位其他肿瘤鉴别，特别是泪腺多形性腺瘤、上皮-肌上皮癌和癌在多形性腺瘤等，可利用MYB基因易位在ACC中的高敏感性和特异性进行鉴别诊断。Chen等[12]收集12例泪腺ACC和25例非ACC良性唾液腺组织，在泪腺ACC中MYB基因易位阳性率为58%(7/12)，在非ACC组织中并未发现MYB基因易位。von Holstein等[3]采用分离探针检测14例泪腺原发ACC和19例非ACC，结果发现7例泪腺ACC存在MYB基因易位，阳性率为50%，非ACC中并未检测到MYB基因易位。Andreasen等[13]收集64例涎腺、泪腺和乳腺ACC，其中9例泪腺ACC经FISH检测后发现5例存在MYB-NFIB融合基因。MYB基因易位在泪腺ACC中具有较高的敏感性和特异性，由于其病例数较少，尚需积累更多病例进一步分析。本组收集16例泪腺ACC，采用MYB断裂基因进行FISH检测，结果发现其阳性率为87.5%(14/16)，在20例泪腺非ACC中并未检测MYB易位，与文献报道一致。

虽然MYB基因易位在ACC中具有较高的敏感性和特异性，但分子遗传学检测MYB阴性的病例并不能完全除外ACC。近年研究显示ACC中还有其它融合基因[6,11,15-19]，同时不同检测材料和方法也影响检测结果。Brill等[14]通过RT-PCR法检测MYB-NFIB融合基因在头颈部ACC中的阳性率，在石蜡组织和冷冻组织中的阳性率分别为44%(14/32)和86%(25/29)。Togashi等[16]采用FISH、RT-PCR和RNA Sequence等方法检测100例ACC，结果显示其中73例存在MYB基因易位，24例存在MYBL1基因易位，阳性率为97%(97/100)，作者发现阳性病例表现形式多样，如果仅使用断裂探针检测阳性率仅为87%(87/100)，MYB断裂探针和MYB-NFIB融合探针双阳性57例，MYB断裂探针阳性而MYB-NFIB融合探针阴性12例，MYB-NFIB融合探针阳性而MYB断裂探针阴性3例。此外，还发现在MYBL1阳性病例中MYBL1断裂探针和MYBL1-NFIB融合探针双阳性18例，MYBL1断裂探针阳性而MYBL1-NFIB融合探针阴性5例，MYBL1断裂探针阴性而MYBL1-NFIB融合探针阳性2例。Fujii等[19]采用断裂探针和融合探针检测33例ACC，其中16例MYB-NFIB、4例MYB-X、2例MYBL1-NFIB、1例MYBL1-X、6例NFIB-X和4例阴性，阳性率为88%(29/33)。Pei等[11]收集7例气管支气管部位ACC，并采用RNA Sequence检测发现MYB-NFIB、MYBL1-NFIB、MYBL1-RAD51B融合基因。由此可见，虽然MYB在ACC中具有较高的特异性，但仍有MYBL1等其他基因突变，且突变的表现形式多样，特别是对于MYB基因易位阴性的病例，仍不能完全排除ACC的可能性，需要检测其他可能存在的基因突变。

关于泪腺ACC是否也具有以上各种基因易位情况，由于标本量少，目前仅有少量相关研究。Andreasen等[13]认为泪腺ACC的基因突变高度集中于MYB和NFIB，而MYBL1则主要发生于唾液腺ACC中。Togashi等[16]收集4例泪腺ACC，在其中1例中发现MYBL1断裂探针阴性而MYBL1-NFIB融合基因阳性。Pei等[11]报道7例气管支气管部位ACC中发现MYBL1-NFIB和MYBL1-RAD51B融合基因。Chen等[12]用MYB断裂基因FISH法检测泪腺ACC，作者认为阴性病例仍不能除外ACC可能性。本实验中用MYB断裂基因检测的16例泪腺ACC有14例阳性，2例阴性，但不能完全除外ACC。目前，多数文献报道认为MYB的免疫组化法检测比分子检测具有更高的敏感性，部分分子检测阴性的ACC也存在MYB蛋白过表达。本组中2例FISH检测MYB阴性的病例也出现了MYB蛋白中等阳性，与既往报道一致。也有研究显示部分非ACC中也出现MYB蛋白的表达[14,20-21]。本组20例泪腺非ACC组织中，并未发现MYB蛋白强阳性，ACC的诊断仍应结合MYB免疫组化和分子检测结果综合分析。对于ACC分子遗传学改变与病理分级和临床特征之间的相关性，仍存在争议。Chen等[12]认为泪腺ACC中MYB基因易位与病理特征及患者预后无关，而Togashi等[16]研究显示MYB/MYBL1基因易位与病理分级有相关性。泪腺ACC中的研究因局限于少数病例，并无大样本分析，缺乏有力证据。本实验有16例患者FISH检测MYB基因易位结果，与患者年龄、性别、肿瘤最大径、病理学分级和预后均无相关性。

泪腺ACC比涎腺ACC临床更为少见，但同样具有特异性的MYB基因易位和MYB蛋白高表达，需联合免疫组化和FISH检测进行诊断。本组泪腺非ACC的恶性肿瘤较少，特别是泪腺腺癌及泪腺腺泡细胞癌均为1例，不能完全除外其他非ACC的泪腺恶性上皮性肿瘤也有MYB蛋白表达或FISH检测MYB基因易位的可能，需进一步分析。同时，FISH检测只采用了断裂探针，并未同时检测其他可能存在的融合基因，不能除外其他基因易位的可能性，具有一定局限性。