花生蛋白水解物制备美拉德反应产物对猪肉脯品质的影响

阮雁春,陈翰玄，刘红艳,俞燕泉,徐健

(1.江苏旅游职业学院 烹饪科技学院，江苏 扬州 225100；2.江苏海洋大学应用技术学院，江苏 连云港 222069)

肉及肉制品能满足人体重要的营养需求，人们对肉制品品质的要求能充分反映出人们的生活现状，随着人们对食品安全的认识，生活水平的提高及消费观念的更新，消费者更需要风味独特和具有保健作用的肉类加工制品。猪肉脯是一种适合消费者闲暇时食用的肉制品，不仅具有独特的风味，还具有较高的营养价值，深受消费者的喜爱。但是，猪肉脯中的饱和脂肪酸含量较高，并且在加工和贮藏过程中容易受到空气、加热和光照的影响，导致猪肉脯中的脂质氧化产生酸败，降低肉制品的风味和感官特性。因此，猪肉脯的脂肪氧化问题一直是困扰其生产与储存的一个关键元素。防止脂质氧化的最直接方式就是添加抗氧化剂。人工合成的抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)与没食子酸丙酯(PG)等，虽然具有很强的抗氧化能力，但这些合成抗氧化剂对人体的肝、脾、肺等均具有较大的毒副作用[1-2]。因此，寻找一些安全、高效的食品添加剂非常有必要。

美拉德反应是指食品体系中羰基与氨基之间发生的一系列反应，拥有一个庞大的反应过程，能够生成具有清除自由基活性的物质[3]。它会从各个方面改变食品的品质，例如味道、颜色和营养效价等。同时，美拉德产物是加工食品和贮藏期间通过自身反应生成的一种产物，而且美拉德产物具有很强的对抗油脂氧化的功效[4]。李鑫等[5]将美拉德反应产物应用于猪肉馅中，结果表明美拉德反应产物可以作为防腐剂，降低猪肉馅的脂肪氧化，延长货架期。在反应的初级阶段，会产生并不稳定的还原酮，最终致使褐变发生。还原酮的金属螯合活性和还原能力在反应产物中出现了抗氧化活性，吡咯、呋喃和吡嗪等挥发性化合物除了能提供很强的抗氧化作用外，还赋予了食品特殊的风味[6]。在反应的最后阶段，聚合和脱水作用将中间产物转化为了类黑精，其中高分子量的化合物有很强的螯合能力，从而达到抗氧化的功效[7-8]。因此，蛋白质与多糖的美拉德反应是获得天然拥有抗氧化效果的添加剂的有效方法之一。本文将花生蛋白水解物(peanut protein hydrolysates，PPH)和半乳糖形成美拉德反应体系，将美拉德反应产物(Maillard reaction products，MRPs)添加到猪肉脯中，探究不同添加量的花生蛋白水解物美拉德反应产物提高猪肉脯的保色作用、抑制蛋白氧化和脂肪氧化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

花生蛋白粉(蛋白含量80%)：黑龙江省北大荒米业有限公司；碱性蛋白酶(酶活为2.4 AU/g)、半乳糖：丹麦诺和诺德有限公司；12月龄的大白猪、公猪：严格按照GB/T 22569-2008《生猪人道屠宰技术规范》进行，4 ℃悬挂排酸成熟24 h，选取猪后腿肉、猪背膘：由临沂新程金锣肉制品集团有限公司提供；鸡蛋、白胡椒粉：市售；食品级复合磷酸盐(三聚磷酸钠、焦磷酸钠与六偏磷酸钠的质量比为2∶2∶10)：西安沐森生物工程有限公司；二硝基苯肼、丙酮、乙酸乙酯、硫代巴比妥酸、三氯乙酸：上海弘顺生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LG10-24A高速离心机 北京医用离心机厂；DHG-9240A型恒温鼓风干燥箱 江苏迅迪仪器科技有限公司；PHS-25型pH计 梅特勒-托利多公司；CM-6000A色差仪 柯尼卡-美能达控股公司。

1.3 方法

1.3.1 花生蛋白水解物的制备

根据Reddy等[9]的方法，将花生蛋白水溶液(4%，W/V)于95 ℃加热处理5 min，pH调到8.0左右，碱性蛋白酶在50 ℃水解5 h，酶与底物浓度之比为1∶100(W/W)。水解结束后，用1 mol/L的NaOH调节pH 至7.0，于95 ℃灭酶5 min。所得水解物在9000×g下离心10 min，最后冻干备用。

1.3.2 美拉德反应产物的制备

根据杜玲玲等[10]的方法，将DPPH的冻干粉末配成20 mg/mL的溶液，加入D-半乳糖，使蛋白与糖的比例为1∶3。充分混合后放入水浴锅中，温度设置为90 ℃，时间为6 h，达到时间后取出立刻冷却。将最终获得的产品在-20 ℃下预冻、冷冻干燥10 h，在4 ℃的密封条件下进行储藏。

1.3.3 猪肉脯的制作

猪肉脯的制作按照曹叶萍等[11]的方法，并稍作修改。为了更好地研究美拉德反应对猪肉脯中脂质氧化的影响，将瘦肉与肥肉按4∶1的比例混合后称取100 g，加入蔗糖22 g、白胡椒粉0.2 g、复合磷酸盐0.15 g、鸡蛋液15 g、鱼露5 g，斩拌后平均分成6份，第1份作为对照，第2～4份中分别含有不同浓度的MRPs(6 h)冻干粉(1.0%、1.5%、2.0%)。混匀后制作成重量为75 g、厚度为2.5 mm的猪肉脯，烤熟后在室温25 ℃条件下贮藏10 d，测定各项指标。

1.3.4 色差的测定

a*值为样品的红色度，用0-CAL板和标准白板进行校准后，将色差仪镜头垂直放置于样品表面测量，镜口紧贴肉面(避免漏光)，每个样品选取不同的截面位置测定 3～5次。

1.3.5 pH值的测定

将猪肉脯研磨后取1.00 g搅碎的样品与10 mL的蒸馏水混合，用玻璃棒搅拌均匀，在室温下放置30 min，用滤纸过滤，用pH计测定pH值。

1.3.6 羰基含量的测定

根据Fagan等[12]的方法。将肉样品加入到缓冲溶液(pH 7.4)中，在打碎后滤得的清液中加入10% TCA后，将离心得到的沉淀用盐酸∶丙酮(3∶100，V/V)混合溶液洗涤2次。将1 mL的二硝基苯肼(10 mmol/L)加到样品中，对照组为2 mol HCl，在25 ℃下每隔15 min涡旋混合1次，持续4次，添加20% TCA 1 mL，离心得到的沉淀用乙酸乙酯∶乙醇(1∶1)混合洗涤3次，再将沉淀用盐酸胍溶液重新溶解后再进行离心，得到的上清液在370 nm处进行比色。羰基含量通过分子消光系数22000 M-1/cm-1进行计算。

1.3.7 TBARS值的测定

参照Yu等的方法并略微调整[13]。将贮藏0，1，4，7，10 d的肉样与硫代巴比妥酸和盐酸-三氯乙酸混合液进行混合，放入沸水浴中加热30 min，冷却后取上述溶液与等体积的氯仿混合，离心后在532 nm处比色，计算公式如下：

TBARS(mg/kg)=A/W×9.48。

式中：A为溶液在532 nm处的吸光值；W为样品的质量，g。

1.4 统计分析

采用Statistix 8.1软件下的General AOV/AOCV对试验数据差异性进行分析，方法为Turkey HSD。此外，试验数据平均值、标准差和方差的计算采用该软件下的描述统计学进行分析，采用Sigmaplot 12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同添加量的MRPs对猪肉脯红度值的影响

色泽是决定猪肉脯品质的重要因素，并影响消费者的感官评价。当猪肉脯发生氧化后，氧合肌红蛋白会转变成灰褐色的高铁肌红蛋白，使猪肉脯的色泽降低[14]。添加不同量MRPs的猪肉脯在各储藏期内a*值的变化趋势见图1。

图1 不同添加量的MRPs对猪肉脯红度值的影响Fig.1 Effect of MRPs with different additive amount on the redness values of dried pork slices

由图1可知，随着储藏时间的增加，所有样品的a*值都呈现明显降低的变化趋势(P<0.05)。猪肉脯中含有一定量的脂肪，在存储期间会与空气中的氧气反应，鲜红色的肌红蛋白逐渐转变为高铁肌红蛋白，致使猪肉脯的红度值降低。并且7 d的储藏期内，对照组的红度值始终低于添加MRPs的猪肉脯。在第7天时，MRPs添加量为2%的猪肉脯和对照组的a*值分别为10.46和9.18。对照组的a*值较低可能是猪肉脯在储藏过程中发生了氧化，生成的高铁肌红蛋白致使猪肉脯的a*值明显下降。然而，当MRPs的添加量为2%时，红度值最大。可见，较高浓度的MRPs能够发挥其抗氧化作用，减少猪肉脯的脂肪氧化，促使肉品保持原有的鲜红颜色，MRPs对猪肉脯储藏期间的保色具有良好的促进作用。各处理组的猪肉脯随着贮藏时间的增加，色泽均呈现显著降低的变化趋势，可见贮藏时间仍影响着猪肉脯的a*值。

2.2 不同添加量的MRPs对猪肉脯羰基含量的影响

羰基是由二硝基苯肼和蛋白反应生成的，通过考察猪肉脯中羰基含量的变化情况，能够进一步反映出蛋白质的氧化程度，羰基含量越高则说明蛋白氧化发生得越剧烈[15-16]。MRPs的添加量对猪肉脯中羰基的生成量具有显著的影响，0～7 d储藏期内猪肉脯羰基含量的变化趋势见图2。

图2 不同添加量的MRPs对猪肉脯羰基含量的影响Fig.2 Effect of MRPs with different additive amount on the carbonyl content of dried pork slices

由图2可知，在7 d的储藏期内，猪肉脯的羰基含量随着储藏期的延长均呈现显著升高的趋势(P<0.05)。与对照组相比，添加MRPs的各个处理组羰基的含量均显著降低，并且在同一储藏时间内，添加MRPs的含量越高，羰基含量越低。贮藏7 d后，对照组的羰基含量增加了近3倍，而添加2% MRPs的处理组羰基含量仅增加了不到2倍。这是因为MRPs能够很好地减少羰基的生成，添加量越多，对蛋白氧化的抑制作用越显著。由此可见，MRPs能够较为明显地解决猪肉脯在储藏过程中蛋白发生的氧化所带来的危害问题。

2.3 不同添加量的MRPs对猪肉脯pH值的影响

由图3可知，不同处理组猪肉脯的pH值随着贮藏期的增加均呈现显著增加的变化趋势(P<0.05)。这是因为猪肉脯中的微生物将肉中的蛋白质逐渐分解成氨以及三甲胺类等碱性物质，从而导致pH值逐渐增大[17-19]。同一贮藏时间下，各处理组之间的pH值具有显著的差异性(P<0.05)。第7天时，对照组与MRPs添加量为1%、1.5%、2%的猪肉脯的pH值分别为6.05，6.12，6.25，6.36，MRPs的添加量越高，猪肉脯的pH值越大。可能是因为美拉德反应能够促进自由基的生成，自由基可能与花生蛋白的侧链发生反应，从而减少酸性基团的数量，导致添加美拉德反应产物的猪肉脯的pH值有所提高。

图3 不同添加量的MRPs对猪肉脯pH值的影响Fig.3 Effect of MRPs with different additive amount on the pH values of dried pork slices

2.4 不同添加量的MRPs对猪肉脯TBARS值的影响

脂质氧化后会生成氢过氧化物，再经过进一步的氧化会生成醛、酮、酸等产物[20-21]，是影响肉制品贮藏品质的重要因素，TBARS值能够反映出油脂二级氧化产物丙二醛的含量[22-23]。由图4可知，各处理组的TBARS值随着储藏时间的增加均呈现逐渐增大的变化趋势(P<0.05)。新制作的猪肉脯中的二级氧化产物较少，但随着储藏时间的增加，各处理组的TBARS值显著增大(P<0.05)。说明随着贮藏期的增加，猪肉脯中的油脂发生氧化，逐渐转化成二级氧化产物，导致猪肉脯的品质逐渐降低。在第10天时，MRPs的添加量为0%、1.0%、1.5%和2.0%时，猪肉脯的TBARS值分别为6.68，5.90，5.24，4.15 mmol/kg。当MRPs的添加量为2%时，MRPs对猪肉脯TBARS值的抑制效果是未加入MRPs样品的1.5倍。这主要是因为MRPs中的类黑精、还原酮具有很强的金属螯合活性和还原能力；吡咯、呋喃和吡嗪等挥发性化合物提供了很强的抗氧化作用，这些物质均能起到对抗脂肪氧化的作用，一定程度上能够抑制二级氧化产物的生成。

图4 不同添加量的MRPs对猪肉脯TBARS值的影响Fig.4 Effect of MRPs with different additive amount on the TBARS values of dried pork slices

3 结论

花生蛋白水解物与半乳糖形成的美拉德反应产物能够改善贮藏期间猪肉脯的品质特性。花生蛋白水解物美拉德反应产物不仅能够对抗脂肪氧化、抑制二级氧化产物的生成，还能够抑制猪肉脯储藏期间的蛋白氧化。此外，美拉德反应产物能够使猪肉脯保持原有的鲜红色，对猪肉脯储藏期间的保色具有良好的促进作用。花生蛋白水解物美拉德反应产物的添加量与猪肉脯的品质呈现正相关的关系。美拉德反应产物的添加量为2.0%时，对猪肉脯的保色效果最显著，羰基含量最低，抑制油脂氧化的作用最强。可见，还原性多糖与蛋白水解物通过美拉德反应生成的产物能够作为新型食品保色剂和抗氧化剂应用到肉类制品中，为生产健康、天然的食品提供了一定的理论基础，并且具有切实可行的实际意义。