海洋产蛋白酶Bacillus amyloliquefaciens MSP05发酵南美白对虾虾壳脱蛋白条件优化

武波飞，丁志雯，苏永成，杨光，侯晓月，房耀维,2，刘姝,2*

(1.江苏海洋大学 食品科学与工程学院，江苏 连云港 222005；2.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222000)

南美白对虾又称白脚虾(Penaeusvannamei)，是对虾科、对虾属虾类，是迄今世界上养殖产量最高的三大优良虾种之一[1]。南美白对虾蛋白质含量较高，富含氨基酸、维生素和矿物质元素，虾肉中多不饱和脂肪酸(EPA和DHA)含量丰富，具有一定的保健功能[2]。南美白对虾虾壳比较柔软，虾肉、虾壳容易剥离，质地松软[3]。我国南美白对虾淡水养殖产量为67.12万吨，海水养殖产量为114.44万吨，占甲壳类水产品养殖总产量的32%[4]。虾肉富含蛋白质和18种氨基酸，其中必需氨基酸占氨基酸总数的38.78%，是一种营养均衡的优质蛋白来源[5-6]。目前，南美白对虾出口数量越来越大，会产生大量的虾壳及虾头废弃物，这部分约占虾总量的30%～40%[7]。以干基计，这些废弃物虾壳中占5.21%的蛋白质、5.32%的矿物质、6.77%的几丁质和1.29%的脂肪[8]。这些废弃物不仅造成了营养物质的浪费，而且造成了环境污染，导致水环境的富营养化。如果能对这些废弃物进行开发利用，则可变废为宝，既解决了环境污染，又带来了经济效益。

几丁质(chitin)，又称壳多糖、甲壳素，是自然界中唯一的天然碱性多糖，无毒性、无刺激性、无免疫抗原性，广泛应用于医药、化工和保健食品等领域[9]。几丁质的溶解性较差，经脱除乙酰基达到55%以上后形成壳聚糖。壳聚糖的溶解性能好，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性，并能进行化学修饰反应。因此，壳聚糖被认为是极具应用潜力的功能性生物材料，广泛应用于食品、轻工、农业、环保、美容等领域[10]。

由虾壳制备几丁质最关键的步骤之一是脱蛋白。传统的脱蛋白方法是浓碱法。该方法对几丁质的结构有一定的破坏，耗能高，其中的蛋白、碳酸钙和其余矿物质均作为废弃物排放，会对环境产生严重污染。运用添加蛋白酶水解的方式脱蛋白可以大大降低环境污染，减少能耗，但是成本较高[11]。运用产蛋白酶微生物对虾蟹壳进行发酵脱蛋白绿色环保，水解产物用回收利用且成本较低，成为极具潜力的虾蟹壳脱蛋白方式[12-13]。本课题组从海洋样品中筛选获得了产耐有机溶剂蛋白酶菌株B.amyloliquefaciensMSP05[14]。本研究利用B.amyloliquefaciensMSP05发酵南美白对虾虾壳脱蛋白，对发酵条件进行优化。

1 材料

1.1 材料与试剂

南美白对虾虾壳：青岛康镜海洋生物科技有限公司；发酵菌种：B.amyloliquefaciensMSP05菌，于实验室-80 ℃保藏；酵母粉、蛋白胨：美国OXOID公司；可溶性淀粉、MnSO4、FeSO4、MgSO4、Tween-20、NaH2PO4、K2HPO4：南京化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MC型电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；FE20型pH计 上海梅特勒-托利多有限公司；JJ-2型组织捣碎匀浆机 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JXN-26型高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 虾壳预处理

将虾壳在100 ℃烘干至恒重，使用组织捣碎机破碎，过筛40目粒径的虾壳。

1.3.2 菌种活化

在无菌条件下，从斜面接种至LB液体培养基，在37 ℃以180 r/min培养至OD600为0.8后作为种子液。按4%接种量将种子液接种至发酵培养基，对发酵条件进行优化。

1.3.3 培养基

固体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂2 g/L，pH 7.2～7.4，在121 ℃灭菌20 min。

种子培养基：液体LB培养基。

初始发酵培养基：可溶性淀粉14.06 g/L，蛋白胨16.28 g/L，酵母膏2.5 g/L，MnSO40.1 g/L，Tween-20 0.1 g/L，NaH2PO43.46 g/L，K2HPO41 g/L，FeSO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，虾壳处理物10%，pH 6.7，在121 ℃灭菌20 min。

1.3.4 南美白对虾虾壳蛋白质的测定

参照国标GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》。

1.3.5 南美白对虾虾壳脱蛋白率的测定

称取20 g南美白对虾虾壳，用200 mL 6% NaOH溶液煮沸1 h，用纱布过滤，将滤渣水洗至中性，用5%的HCl溶液浸泡24 h，每4 h搅拌一次，纱布过滤，将滤渣水洗至中性后烘干，测定蛋白质含量，计算脱蛋白率[15]。

蛋白质去除率(%)=(原料中总蛋白质量-滤渣中蛋白质量)/原料中总蛋白质量×100。

1.3.6 发酵条件对产蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05发酵南美白对虾虾壳脱蛋白的影响

发酵时间60 h，发酵转速200 r/min，初始pH 6.7，发酵温度37 ℃，装液量20%，接种量4%，虾壳处理物10%。依次对发酵时间(0，12，24，36，48，60，72 h)、发酵转速(160，180，200，220 r/min)、初始pH值(6.3，6.5，6.7，6.9，7.1)、发酵温度(35，37，39，41 ℃)、装液量(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、接种量(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%)进行单因素试验，以脱蛋白率为指标，探讨蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05发酵南美白对虾壳脱蛋白的影响。

1.3.7 响应面优化产蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05发酵南美白对虾虾壳脱蛋白条件

根据单因素结果，选择对发酵脱蛋白影响最显著的转速、温度和装液量为因素，以脱蛋白率高低为响应值，运用Design Expert 11设计3因素3水平共17个Box-Behnken响应面分析试验[16]。在最佳条件下对响应面分析结果进行验证，测定脱蛋白率。

1.3.8 数据处理

所有试验数据均为重复3次试验后的平均值，响应值试验结果采用Design Expert 11软件进行分析处理，数据绘图采用Origin 2018软件。

2 结果与分析

2.1 发酵条件对B. amyloliquefaciens MSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响

2.1.1 发酵时间对B.amyloliquefaciensMSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响

发酵时间对B.amyloliquefaciensMSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响见图1。

图1 发酵时间对B. amyloliquefaciens MSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响Fig.1 Effect of fermentation time on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由图1可知，脱蛋白率随着发酵时间的延长而不断增加，在菌株发酵培养48 h时，脱蛋白率达到最高值91.94%，之后随着发酵时间的延长，脱蛋白率下降。随着反应的进行，培养基的营养物质及生长因子不断地消耗，菌株产蛋白酶水平下降[17]。

2.1.2 发酵转速对B.amyloliquefaciensMSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响

由图2可知，转速为200 r/min时脱蛋白率最高，为94.99%，转速在160～200 r/min之间，随着转速的增加，蛋白酶活力增大，说明转速增大，溶氧增大，有利于产酶；当转速大于200 r/min时，蛋白酶活力不再升高反而有所下降，可能是转速继续增大，剪切力会导致蛋白酶失活[18]。

图2 发酵转速对发酵时间对B. amyloliquefaciens MSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响Fig.2 Effect of rotating speed on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

2.1.3 初始pH对B.amyloliquefaciensMSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响

发酵初始pH对B.amyloliquefaciensMSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响见图3。

图3 初始pH对B. amyloliquefaciens MSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响Fig.3 Effect of initial pH value on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由图3可知，随着初始pH的升高，脱蛋白率先升高后下降，在初始pH值为6.7时最高，脱蛋白率为91.65%。pH影响酶的活性和稳定性，从而影响脱蛋白效率[19]。

2.1.4 发酵温度对B.amyloliquefaciensMSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响

由图4可知，在39 ℃时脱蛋白率达到最高95.49%，当温度超过39 ℃时，脱蛋白率持续下降。温度影响微生物发酵产酶水平，也影响酶活性，从而影响蛋白脱除率[20]。

图4 发酵温度对B. amyloliquefaciens MSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

续 表

2.1.5 装液量对B.amyloliquefaciensMSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响

装液量对B.amyloliquefaciensMSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响结果见图5。

图5 装液量对B. amyloliquefaciens MSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响Fig.5 Effect of liquid loading volume on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由图5可知，当摇瓶的装液量为20%时，脱蛋白率达到最高值，为90.75%。装液量与发酵液溶氧相关，装液量过高，溶氧偏低，导致菌株生长变缓，发酵产酶水平降低。

2.1.6 接种量对B.amyloliquefaciensMSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响

由图6可知，接种量的大小影响脱蛋白的效率。接种量为4%时，脱蛋白率达到最高值90.35%。进一步增加接种量，脱蛋白率不再显著增加。接种量过小会导致菌株延滞期变长、发酵产酶水平低。考虑到成本问题，选择4%为最佳接种量。

图6 接种量对B. amyloliquefaciens MSP05南美白对虾虾壳脱蛋白率的影响Fig.6 Effect of inoculation amount on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

2.2 响应面优化产蛋白酶B. amyloliquefaciens MSP05发酵南美白对虾虾壳脱蛋白

2.2.1 响应面试验设计

以发酵转速B(r/min)、温度(℃)和装液量(%)为显著影响因素，见表1。运用Design Expert 11设计三因素三水平共17个试验点的Box-Behnken进行组合优化，其中包括5个最优试验点，试验结果见表2。

表1 响应面优化法各因素和水平设计Table 1 The factors and levels of response surface experiment

表2 响应面试验设计结果Table 2 The response surface experiment design and results

利用Design Expert 11软件对表3中的数据进行分析处理，得到以Y为因变量，发酵转速、温度和装液量为自变量的二次多项式方程：Y=93.89+2A-2.4B+0.4775C+0.1075AB-3.57AC+3.92BC-0.1278A2-3.04B2-8.92C2。

使用Design Expert进一步对拟合出的回归方程进行误差统计分析，对方差和多元相关系数进行计算，对此模型进行方差分析及显著性变化，结果见表3。

表3 回归模型方差分析和系数显著性检验Table 3 The variance analysis and coefficient significance test of regression model

由表3可知，回归模型的P值为0.0001，显著性分析(P<0.01)为极显著；失拟项的P值为0.8511>0.05，说明模型的拟合程度良好，影响拟合的因素对试验结果干扰很小[21]。A、B、AC、BC、B2和C2对脱蛋白效果的影响极显著。方程的决定系数R2=0.9760>0.9，表明产蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05发酵南美白对虾壳脱蛋白率预测结果具有一致性，模型相关度好。试验模型的校正系数RAdj2=0.9450，表明模型的拟合程度较高[22]，说明有94.5%的试验结果可以用此模型来解释，因此结果可靠，模型可以对产蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05发酵南美白对虾壳脱蛋白率值进行分析和预测，由回归方程式中一次项系数可知，各因素对产蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05发酵南美白对虾虾壳脱蛋白率作用大小顺序为：温度(B)>转速(A)>装液量(C)。

2.2.2 响应面分析与条件优化

响应曲面的形状反映各因素间的交互作用的显著性，响应曲面越陡峭，表明该因素对试验结果的影响越显著，曲面顶点为交互因素最佳取值的试验结果[23-24]。由图7可知，温度与转速、转速与装液量以及装液量与温度交互作用的显著性与表3中交互项P值的分析结果一致，(a)，(c)，(e)均呈椭圆形，表明因素间的交互作用显著，等高线的形状可以判断交互作用的强弱，3组等高线图中转速和温度作用最好，等高线中的曲面围绕着响应面在中间处形成顶点，即脱蛋白率最大值，a，c，e响应面图开口朝下，随着每个因素的增加而响应值减小，响应面的顶点即为最大响应值。

(a)

2.2.3 响应面优化验证试验

利用Design Expert 11软件得到脱蛋白的最佳发酵工艺：转速200.5 r/min、温度38.5 ℃、装液量19.5%。为方便实际操作，将最佳工艺条件设为：转速200 r/min、温度39 ℃、装液量20%。在此条件下做3次试验，脱蛋白率达95.40%±0.014%，接近理论预测值96.47%。

2.2.4 热碱法脱南美白对虾虾壳蛋白

利用热碱法脱除南美白对虾虾壳蛋白，脱蛋白率达到 97.8%±2.1%，高于最佳条件下发酵法脱除南美白对虾虾壳蛋白率。但是热碱法能耗高，排出大量污染废水，污染环境。另外，强酸、强碱对几丁质的分子结构有一定的破坏[25]。因此，本研究优化获得的发酵法脱除南美白对虾虾壳蛋白绿色环保、能耗较低，具有工业应用潜力。

3 结论

以 南美白对虾虾壳为原料，采用产蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05通过发酵南美白对虾虾壳脱蛋白，以脱蛋白率为考察指标，脱蛋白率为80.28%。在单因素优化的基础上，通过Box-Behnken试验设计和响应面分析，最终获得最佳发酵脱蛋白参数为：转速200 r/min、温度39 ℃、装液量20%。在此条件下得到的脱蛋白率为96.47%，较优化前提高了16.7%。