一株广谱抗菌甲基营养型芽孢杆菌的筛选及其产抗菌脂肽的鉴定

杨 艳 宇，冀 倩 倩，孙 建 东，王 健 伟，齐 洪 庆，刘 影，简 凡 杰，李 成

(大连工业大学 生物工程学院,辽宁 大连 116034 )

0 引 言

海洋具有低温、高压、弱光、高盐等特殊的生态环境特点，使得来源于海洋的微生物具有许多陆生微生物不具备的特性[1-2]。关于海洋微生物及其代谢的具有新颖的、生物学活性的次级代谢产物的研究日益增多，海洋微生物越来越受到国内外学者的广泛关注。从海洋中筛选产抑菌活性物质的海洋微生物也成为目前研究的热点之一[3-4]。

近年来，在海洋中已经筛选到许多具有抗菌活性物质的芽孢杆菌菌属，包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌等。汪晶晶等[5]在连云港海域海水中分离得到一株对白色念珠菌(Canidiaalbicans)的生长具有明显的抑制作用的海洋解淀粉芽孢杆菌。Ma等[6]从海洋沉积物中筛选出来的解淀粉芽孢杆菌SH-B74，代谢物种的环脂肽pliastatin A1对番茄灰霉病的病原菌灰霉病菌B.cinerea的孢子萌发具有很强的抑制作用。田良等[7]在仿刺参饲养实验中利用筛选的甲基营养型芽孢杆菌制成的复合益生菌悬液提高仿刺参生长率。魏新燕等[8]发现源自海洋中的一株甲基营养型芽孢杆菌BacillusmethylotrophicusBH21，对葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)有较好拮抗作用，通过鉴定确定该菌株具有芽孢杆菌属脂肽类抗菌物质合成基因，且其发酵代谢相应的脂肽类物质。在芽孢杆菌种属中，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)作为芽孢杆菌属的“后起之秀”，因其代谢产物的多样性、对外界环境因子的多抗逆性和无污染无毒害等优点，近年来被越来越多运用于农业、医学、商业等领域[9-10]。

本实验从大连地区仿刺参养殖圈的海水中通过筛选得到一株对多种病原菌具有较好的抑菌效果的菌株——甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus，命名为B.methylotrophicus6112，并对其发酵代谢的抗菌物质进行了初步的分离及鉴定。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样 品

取自大连地区仿刺参养殖圈的表层海水。

1.1.2 指示菌

4种指示菌(病原菌)分别为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、溶壁微球菌(MicrococcusLysodeikticus)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichiacoli)，均为本实验室保存。

1.1.3 培养基

LB培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，1 000 mL去离子水，pH 7.4。

通用分离液体培养基：牛肉膏4 g，蛋白胨4 g，酵母膏1 g，葡萄糖10 g，氯化钠0.25 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0。

LB固体培养基和通用分离固体培养基，均加入20 g琼脂。

1.1.4 主要试剂和仪器

结晶紫染色液、碘液、番红染色液等，分析纯，大连美仑生物技术有限公司。

V-1000型可见分光光度计，翔艺仪器(上海)有限公司；湘仪H2050R-1医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Multiskan Go酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；MALDI-TOF，ABSCIEX中国公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的初步分离及初筛

从大连市仿刺参养殖圈内采集海水样本，按1.5%接种量接入通用分离液体培养基内富集培养24 h。按10-1～10-9梯度稀释后取20 μL分别涂布到固体培养基，30 ℃倒置培养24 h。再用灭菌牙签挑取每个单菌落点样至新的固体培养基，继续培养。在指示菌M.Lysodeikticus的平板上，进一步筛选对其有抑菌效果的菌株。

1.2.2 高产广谱抗菌活性物质细菌的筛选

分别活化革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞杆菌、大肠杆菌，并制备抑菌指示平板，筛选高产广谱抗菌的菌株。随后将筛选出的菌株筛选单菌落，连续传代培养，并利用牛津杯法检测菌株对4种指示菌的抑菌活性及抑菌稳定性。

1.2.3 菌株的鉴定

将筛选的菌株进行发酵培养，离心取菌体后，革兰氏法染色，显微镜检测菌体形态(1 000倍)，并观察菌落形态。

利用16S rDNA对菌种进行鉴定。菌落PCR引物：8F，5′-CAAGTCGAGCGGACAGAT-GGGAGCT-3′；1 492R，5′-AGCTCCCATCTGTC-CGCTCGACTTG-3′。PCR反应体系(50 μL)：2×Taq PCR Mater Mix 25 μL，27F(10 μmol/L)2 μL，1 492R (10 μmol/L)2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，90 s；35次循环；72 ℃，5 min。PCR产物送生工生物技术有限公司进行测序。经Clustal X比对后，用软件MEGA 7.0采用Maximum Likelihood法构建菌株的系统发育树进行鉴定。

1.2.4 菌株发酵液的抗生物膜作用

取溶壁微球菌、铜绿假单胞杆菌和灿烂弧菌菌液，用LB培养基将细菌浓度稀释至108CFU/mL。取100 μL稀释菌液加入96孔板中，对照组为200 μL的LB培养基，向实验组内加入50 μL目标菌体的发酵液上清液，37 ℃培养24 h。吸出上清培养基后用0.9% NaCl漂洗3次。恒温培养箱37 ℃培养24 h后，结晶紫染色法测定生物膜含量。培养结束后，吸弃培养基，再用0.9% NaCl漂洗3次，96孔板的每个实验孔中加入100 μL 甲醇，固定15 min，吸弃甲醇，挥干残留甲醇后加入50 μL 0.1%结晶紫溶液，染色30 min，去除结晶紫溶液，去离子水漂洗3次后加入33%醋酸溶液溶解结晶紫，用酶标仪在570 nm处测定各个孔的吸光度。

1.2.5 酸沉法分离粗提物并检测其抑菌活性

利用盐酸沉淀和甲醇抽提法提取菌株发酵上清中的抑菌物质[8，11]。菌株发酵48 h后，发酵上清液中加入6 mol/L的HCl，置于4 ℃冰箱过夜沉淀。初步分离上清和下层悬浊液后，用甲醇溶解沉淀物，用0.22 μm的有机滤膜过滤，40 ℃旋转蒸干得到此菌株代谢的抗菌物质的酸粗提物。

称取3 mg粗提物溶于1 mL色谱级甲醇中制备抑菌样品，0.22 μm滤膜除杂质。以溶壁微球菌、铜绿假单胞杆菌和灿烂弧菌为指示菌，牛津杯法检测其抑菌活性[12]。再利用比浊法进行活性分析，将溶壁微球菌，铜绿假单胞杆菌和灿烂弧菌接种至含100 μL培养基的96孔板，加入10 μL 酸沉粗提物，37 ℃培养24 h后，600 nm处检测吸光度，以未加入抑菌粗提物的样品作为对照组，每组3个平行。

1.2.6 抑菌活性物质的初步鉴定

将目标物质及其辅助解离的基质物质点样于基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)的检测平台上。利用MALDI-TOF-MS及Data Explorer软件，依据样品的质荷比(m/z)，测得目标物质的相对分子质量，通过比对初步确定菌株所产的脂肽类化合物的种类[13]。

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离、筛选及鉴定

从刺参养殖海水中筛选出一株对4种指示菌均具有较好抑菌效果的菌落。菌株菌落形状相对规则，边缘凸起中间凹陷且相对整齐，乳白色不透明半湿润的圆形(图1(a))，属于革兰氏阳性杆菌(3 μm×1 μm)(图1(b))。16S DNA测序后比对，构建系统发育树，如图2所示。结果确定该菌株与Bacillusmethylotrophicusstrain HB25(KM659226.1，99.56%)聚在同一分支，且支持率为94，亲缘关系最为接近，确定实验筛选出一株产广谱抗菌活性物质的甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicu，命名为B.methylotrophicus6112。

2.2 菌株B. methylotrophicus 6112发酵液的抗细菌生物膜作用

芽孢杆菌在自然界中分布广泛，它们能代谢分泌多种抑菌物质，包括脂肽类、肽类以及细菌素等，其中抗菌脂肽类是芽孢杆菌种属产生的最常见的一大类抑菌物质[14]。目前，研究人员从海洋中分离的多种甲基营养型芽孢杆菌中，均发现含有一种或多种环脂肽类化合物[15]。因此，将检测甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus6112是否会代谢产生抗菌脂肽类化合物。细菌生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被一些生物大分子包裹的细菌群体，具有极强的耐药性，一旦微生物形成生物膜，常规的抗菌类物质如抗生素类或多肽类抑菌物质将失去抑菌作用。但是，近几年有研究表明，芽孢杆菌属的抗菌脂肽类物质具有抗微生物生物膜的作用[16-17]，其能通过洞穿菌体细胞膜使其死亡或与已形成的生物膜上的脂质或蛋白质结合导致其基本组织结构解体从而抗微生物生物膜的形成。

(a)菌落形态

注：括号中序号代表菌株序列号；分支点上的数字代表可信度，数值越大，可信度越强；标尺代表遗传距离，标尺越短代表亲缘关系越近。图2 菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the strain

本实验利用结晶紫染色法检测分析甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus6112发酵液中的抑菌活性物质对溶壁微球菌、铜绿假单胞杆菌和灿烂弧菌3种指示菌的抗生物膜作用。如图3所示，与对照组相比，3种指示菌中加入发酵上清液后，OD600均显著下降，尤其是仿刺参的致病菌灿烂弧菌组下降最明显，表明发酵液中的抑菌活性物质可以抗3种微生物形成的生物膜。推测甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus6112可能在发酵液中代谢产生了抗菌脂肽类物质。

图3 B. methylotrophicus 6112发酵液对3种不同菌形成的生物膜的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of fermentation broth of B. methylotrophicus 6112 on biofilm formed by three different strains

2.3 菌株B. methylotrophicus 6112抑菌脂肽类活性物质的分离、提取及其活性检测

抗菌脂肽类物质通常是由脂肪酸链和肽链两部分分别以内脂或者酰胺键结合的方式形成，研究发现大多数脂肽类物质均具有耐强酸的性质。因此，酸沉法是抗菌脂肽类物质粗提取的最为常用的方法。本研究利用酸沉法结合醇萃取法提取发酵液中的脂肽类物质，结果如图4(a)所示。以金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌和灿烂弧菌作为指示菌，分别利用牛津杯法(图4(b))及比浊法(图4(c))检测了酸沉粗提物的抑菌活性。结果表明，当培养基中加入适量的酸沉粗提物后，3种指示菌的生长均受到了不同程度的抑制，表明甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus6112发酵液的酸沉粗提物具有抑菌作用。

2.4 菌株B. methylotrophicus 6112发酵液的粗提物中的抗菌脂肽类物质的初步鉴定

研究表明，芽孢杆菌代谢的抗菌环脂肽主要包括伊枯草菌素(Iturin)、芬荠素(Fengycin)和杆菌霉素(Surfactin)三类，它们的具体组成及相对分子质量都是已知的。利用MALDI-TOF-MS对菌株B.methylotrophicus6112的酸沉粗提物进行解析。扫描范围涵盖所有已知抗菌脂肽类物质的质荷比(800～3 000)，发现粗提物抗菌脂肽质荷比主要集中在1 000～1 600。如图5所示，B.methylotrophicus6112的酸沉粗提物中含有多种抗菌脂肽类物质。如表1所示，粗提物包括3种类型的抗菌脂肽类物质：一是伊枯草菌素家族，包括伊枯草菌素C14和伊枯草菌素C15；二是芬荠素家族，包括芬荠素C15、芬荠素C16、芬荠素C17、芬荠素C18；三是杆菌霉素C15。结果表明，菌株B.methylotrophicus6112能够代谢产生三类抗菌脂肽类物质。

(a)脂肽类物质粗提物

图5 MALDI-TOF-MS检测菌株B. methylotrophicus 6112发酵液酸沉粗提物质的相对分子质量Fig.5 The molecular weight of crude extraction of strain B. methylotrophicus 6112 fermentation supernatant obtained by acid precipitation detected by MALDI-TOF-MS

表1 MALDI-TOF-MS检测菌株B. methylotrophicus 6112粗提物中抗菌脂肽的质荷比Tab.1 Antimicrobial lipopeptides in crude extracts of strain B. methylotrophicus 6112 detected by MALDI-TOF-MS

尽管在所检测的区间内粗提物中的绝大多数成分通过比对发现属于脂肽类化合物，但也存在不确定的成分，如m/z=1 100 处的物质不能确定具体组分；同时待测物为粗提品，因此实验不能确定菌株B.methylotrophicus6112是否还能产生其他类型的抑菌活性物质，这需要进一步的分离、纯化及分析、鉴定。

3 结 论

以溶壁微球菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌4种病原菌作为指示菌，从大连市仿刺参养殖圈的海水中筛选出1株能够产广谱抗菌活性物质的甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus6112。结果表明，B.methylotrophicus6112能产生3种抗菌脂肽类物质，分别为伊枯草菌素、芬荠素以及杆菌霉素。