早卵泡期长效长方案添加不同外源性黄体生成素制剂对低黄体生成素患者体外受精-胚胎移植临床结局的影响

于 莲，南 燕，王 慧，刘 洋，李玉洁

(新乡医学院第三附属医院生殖医学科，河南 新乡 453003)

促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist,GnRH-a)可使LH峰得到控制，卵泡发育与内膜同步化，对辅助生殖技术具有重要意义。目前，GnRH-a对垂体降调后给予促性腺激素(gonadotrophin,Gn)进行控制性超促排卵的长方案被多数生殖中心所采用，并取得了较好的临床妊娠率[1]。但在临床实践中发现，部分患者在早卵泡期长效长方案中使用GnRH-a进行垂体降调后出现垂体过度抑制，导致血清黄体生成素(luteinzing hormone，LH)水平降低，对卵母细胞质量、受精率、优质胚胎及种植率等造成不良影响。目前，采用在早卵泡期长效长方案中垂体降调后出现低LH水平时添加外源性LH制剂。在临床上较多使用的外源性LH制剂有重组黄体生成素(recombinant follicle-stimulating hormone,r-LH)和人绝经促性腺激素(human menopausal gonadotropin,HMG)。r-LH 是采用基因工程所获得的一种糖蛋白，r-LH在结构和功能上与生理性LH很相似，且药物批次稳定，在辅助生殖领域中被广泛使用。HMG是由绝经妇女尿中提取出来的Gn，其价格低廉且安全有效，但HMG制剂中含有>30%的杂质，批次间差异较大，活性不稳定。HMG中95%的LH活性是由人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)驱动，具有LH相似的功能。但LH与HCG在化学结构、生物学功能以及其作用的信号通路均有差异：LH与受体结合后，主要选择细胞外调节蛋白激酶和蛋白激酶A通路，介导细胞增殖、分化，促进卵泡生长；HCG与受体结合后，通过环磷酸腺苷途径促进雄激素和雌激素合成，从而促进卵子成熟和排卵[2]。与LH相比，HCG糖基化幅度大，具有更长的半衰期，生物活性更强[3]。因此，推测r-LH和HMG可能会引起临床结局的不同。基于此，本研究比较早卵泡期长效长方案添加r-LH和HMG对低LH患者体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)临床结局的影响，为临床药物应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年4月至2020年5月于新乡医学院第三附属医院生殖医学科行IVF-ET助孕并采用早卵泡期长效长方案的不孕女性患者为研究对象。病例纳入标椎：(1)年龄≤42岁；(2)垂体降调节后LH<1.0 U·L-1；(3)卵巢储备功能正常[基础促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)<10 U·L-1，窦卵泡数(antral follicle count，AFC)>5个]；(4)不孕原因主要是女性输卵管不通或功能障碍、轻度子宫内膜异位症及少精和弱精等男方原因。排除标准：(1)多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者；(2)染色体异常；(3)子宫畸形；(4)患有遗传病、严重躯体疾病和精神心理障碍，接触致畸量的射线、毒物等；(5)3 个月内服用过口服避孕药者。本研究共纳入238例患者，根据卵泡直径在12～14 mm时添加外源性LH制剂的不同分为r-LH组(n=116)和HMG组(n=122)。r-LH组：年龄20～43(30.90±4.10)岁，不孕年限1～17(3.25±1.93)a，体质量指数(body mass index，BMI) 6.6～35.0(23.61±3.59)kg·m-2，AFC 4～23(13.22±4.13)个，抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)14～23(3.57±2.30)μg·L-1，基础FSH 1.6～18.5(8.23±2.51) U·L-1，基础 LH 0.2～10.0(4.37±2.16) U·L-1，基础雌二醇(estradiol，E2) 19～81(35.95±12.55)ng·L-1，基础孕酮(progesterone，P) 0.10～0.30(0.91±1.18) μg·L-1。HMG组：年龄20～43(31.11±4.10)岁，不孕年限1～20(3.74±2.13) a，BMI 15.6～37.1(23.32±3.59) kg·m-2，AFC 2～25(13.72±4.52)个，AMH 0.56～17.81(4.00±2.80)μg·L-1，基础FSH 2.7～19.3(8.64±2.36)U·L-1，基础LH 0.6～13.9(4.44±2.00) U·L-1，基础E210.3～82.9(34.58±12.13) ng·L-1，基础 P 0.12～2.45(0.74±0.46)μg·L-1。2组患者的年龄、不孕年限、BMI、AMH、AFC、基础FSH、基础LH、基础E2、基础P比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获医院伦理委员会审核批准[伦理审批号：K2020-063-01]。

1.2 促排卵方案2组患者均采用早卵泡期长效长方案：于月经第2天肌内注射长效GnRH-a[辉凌(德国)制药有限公司，进口药品注册证号H20140123]3.75 mg 进行垂体降调节，于用药28～42 d行阴道超声及性激素检查，当子宫内膜厚度<5 mm、双侧卵泡直径<5 mm、血清FSH<5 U·L-1、LH<5 U·L-1、E2<50 ng·L-1后，每天给予重组人促卵泡激素(recombinant follicle stimulating hormone,r-FSH)(瑞士默克雪兰诺有限公司，进口药品注册证号S20160039)150～300 U·d-1；当卵泡直径在12～14 mm时添加外源性黄体生成素，r-LH组患者皮下注射r-LH(默克雪兰诺德国制药有限公司，进口药品注册证号S20130058)75 U；HMG组患者肌内注射HMG(丽珠医药集团股份有限公司，国药准字H10940097)75 U。根据促排卵期间卵泡大小、雌激素水平调整Gn剂量，当2～3个优势卵泡直径≥18 mm或3个优势卵泡直径≥17 mm，血雌激素水平达到平均每个优势卵泡200～250 ng·L-1时，当日给予注射用绒促性素(丽珠医药集团股份有限公司，国药准字号H44020674)1 000～2 000 U联合重组人绒促性素注射液(默克雪兰诺德国制药有限公司，进口药品注册证号S20130091)250 μg，注射当日称为HCG注射日；用药后36～37 h在阴道B超引导下取卵。

1.3 体外受精胚胎移植取卵后常规体外受精或卵泡浆内单精子显微注射，受精后16～18 h在倒置显微镜下观察受精情况，受精后有2个原核(pronucleus，PN)为正常受精卵即2PN卵，不具有2个PN为异常受精卵。第3天观察胚胎发育情况，胚胎等级划分如下：根据胚胎卵裂球大小、碎片所占胚胎的比例进行分级，共分为4级，Ⅰ级：卵裂球形状规则，大小均匀，有完整的透明袋，碎片≤5%；Ⅱ级：卵裂球形状略不规则，大小略不均匀，碎片6%～20%；Ⅲ级：卵裂球形状不规则，大小明显不均匀，碎片21%～50%；Ⅵ级：细胞大小严重不均匀，碎片>50%。依据Istanbul共识胚胎评分标准进行优质胚胎评判：卵子受精后第2天卵裂为4个细胞，第3天7个细胞以上，卵裂球大小均匀，碎片小于20%的Ⅰ～Ⅱ级胚胎。取卵当日开始给予肌内注射黄体酮(广州白云山明兴制药有限公司，国药准字号H44020229)40 mg，每日2次，至移植后14 d，若血清HCG阳性至移植后50 d开始减量，若HCG 阴性则停药；地屈孕酮(雅培医疗保健产品有限公司，进口药品注册证号H20170221)10 mg，口服，每日2次，至移植后14 d，血清HCG阳性继续服用至孕10～12周停药，若HCG阴性则停药。于取卵后第3天，取优质胚胎进行子宫内移植；移植后35 d左右行超声检查，若宫腔内可见孕囊则确诊为临床妊娠。

1.4 观察指标

1.4.1 促排卵指标(1)降调时间：从开始使用降调药物至Gn启动日的时间；(2)Gn总量及使用时间：统计促排期间Gn药物使用总量(r-LH组为r-FSH+r-LH；HMG组为r-FSH+HMG)及Gn使用时间；(3)HCG注射日子宫内膜厚度：于注射HCG当日，应用Prosound SSD-3500彩色超声诊断仪(上海阿洛卡医用仪器有限公司)检测子宫内膜厚度；(4)E2、P及LH水平：于HCG注射日应用Access全自动微粒子化学发光免疫系统(美国贝克曼库尔特有限公司)检测患者空腹静脉血E2、P水平，于添加LH日和HCG注射日应用Access全自动微粒子化学发光免疫系统(美国贝克曼库尔特有限公司)检测患者空腹静脉血LH水平。

1.4.2 实验室及临床结局指标(1)记录患者获卵数、MII卵数、受精数(正常受精+异常受精)、2PN卵数、卵裂数、优质胚胎数、全胚冷冻周期数、有可移植胚胎的周期数、妊娠周期数、移植周期数；(2)计算受精率、2PN卵率、MII卵率、全胚冷冻周期率、优质胚胎率、种植率及临床妊娠率。受精率=受精数/获卵数×100%，2PN卵率=2PN卵数/获卵数×100%，MII卵率=MII卵母细胞数/获卵数×100%，全胚冷冻周期率=全胚冷冻周期数/有可移植胚胎的周期数×100%，优质胚胎率=优质胚胎数/2PN数×100%，种植率=孕囊数/总移植胚胎数×100%，临床妊娠率=妊娠周期数/移植周期数×100%。

2 结果

2.1 2组患者促排卵指标比较结果见表1。2组患者的降调时间、Gn启动量、Gn总量、HCG注射日E2水平、HCG注射日子宫内膜厚度比较差异均无统计学意义(P>0.05)；r-LH组患者Gn使用时间、添加LH日血LH水平、HCG注射日P水平低于HMG组，HCG注射日LH水平高于HMG组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组患者促排卵指标比较Tab.1 Comparison of ovulation induction index of patients between the two groups

2.2 2组患者实验室及移植后临床结局指标比较结果见表2。2组患者获卵数、2PN卵数、MII卵数、卵裂数、受精数、优质胚胎数、受精率、2PN卵率、MII卵率、全胚冷冻期率、种植率、临床妊娠率比较差异均无统计学意义(P>0.05)；r-LH组患者优质胚胎率高于HMG组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 2组患者实验室及移植后临床结局指标比较Tab.2 Comparison of laboratory indicators and post-transplant clinical outcome of patients between the two groups

3 讨论

早卵泡期长效长方案促排过程中使用GnRH-a具有抑制内源性LH的合成和分泌、预防早发LH峰出现、避免卵泡成熟前出现LH峰等优点，逐渐成为辅助生殖的主流方案[4]，但GnRH-a的使用会使部分患者垂体功能度过抑制，造成内源性LH水平过低。近年来，有关长方案GnRH-a导致的内源性LH水平过低对卵母细胞质量、受精率、优质胚胎数及种植率等造成不良影响的问题引起辅助生殖界的关注。研究发现，LH水平过低显著降低了子宫内膜间质细胞中内膜容受性标志物同源基因A(homebox,HOXA10)水平的表达，影响子宫内膜的容受性，降低了胚胎的着床率及临床妊娠率，使流产率增加。另外，LH可刺激并促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,当LH处于低水平时，卵泡液中的VEGF水平降低，导致卵泡周围血管的微循环形成不足，引起卵母细胞及颗粒细胞的氧供不足，改变了纺锤体的结构，导致同源姐妹染色体在减数第一次分裂时不分离，造成染色体异常、卵母细胞的受精能力降低及早期胚胎发育障碍[5-6]。根据两细胞两促性腺激素学说，卵泡的生长发育成熟离不开促性腺激素，FSH直接促进窦前卵泡及窦卵泡颗粒细胞增殖与分化，促使卵泡生长。LH与LH受体结合后利用胆固醇合成孕激素，转化为雄激素，为雌激素的形成提供底物；另外，LH增加颗粒细胞对FSH的敏感性，促进卵泡募集。近年来研究显示，在直径为3～10 mm的卵泡中，80%的卵泡颗粒细胞已有LH受体的表达[7]，表明在更小的窦卵泡阶段颗粒细胞上已经存在有功能的LH受体，且与卵泡液内的雌激素、雄激素、AMH、抑制素B相关，这一研究的结论，使得两细胞两促性腺激素学说得到扩展。

多项研究和荟萃分析显示，在体外受精(invitrofertilization,IVF)刺激周期中，添加LH对增加卵母细胞的成熟度、改善胚胎质量有着重要的作用，因此，理论上添加外源性LH制剂可弥补内源性LH的不足[8-11]。研究表明，在促排卵过程中，对于降调后Gn启动日血清LH水平较低的卵巢反应性正常患者，添加r-LH可降低HCG日血清P水平，而高孕酮水平可能会造成新鲜周期胚胎移植的活产率降低[12-13]，这可能是因为高P提前使子宫内膜过早转化为分泌期，种植窗口前移，造成内膜与胚胎发育不同步。对于临床妊娠率来说，国内学者认为，在促排卵中后期添加r-LH与添加HMG相比可获得较高的临床妊娠率[14]；REVELLI 等[15]研究表明，当获卵数>8个时，接受r-LH治疗的患者临床妊娠率和活产率会更高。李颂军等[16]研究发现，添加r-LH可减少Gn使用时间和总量，增加顶级优质胚胎数，临床妊娠率和活产率有增高趋势。但是有学者认为，对于垂体降调后低LH水平的患者添加外源性LH并无临床意义[17]。国外一项荟萃分析表明，低基础LH水平(1.0 U·L-1)的妇女妊娠率并不比GnRH-a降调后LH水平保持正常的妇女低，且补充r-LH组与未补充r-LH组患者的临床妊娠率比较差异无统计学意义；而对于低反应的患者及36～39岁患者补充r-LH似乎是有益的[10]。XIA等[18]研究证实，对于降调后LH<0.75 U·L-1患者，生化妊娠率、临床妊娠率和持续妊娠率与体内LH水平无关。本研究结果显示，r-LH组患者Gn使用时间、添加LH日血LH水平、HCG注射日P水平低于HMG组，HCG注射日LH水平高于HMG组，且r-LH组患者优质胚胎率显著高于HMG组；这一结果提示，与添加HMG相比，添加r-LH后可使内源性LH水平显著增加，从而显著降低凋亡相关因子VEGF水平、减少颗粒细胞凋亡，促使卵母细胞减数分裂，完成第一极体的排出，从而增加优质胚胎的获得，且缩短了Gn使用时间，临床上应用更安全[19]。

综上所述，早卵泡期长效长方案中垂体降调后LH低水平的患者添加r-LH与添加HMG相比，可显著提高内源性LH水平和优质胚胎率，减少Gn使用时间；但二者对种植率、临床妊娠率的影响并无差异，这需要进一步研究予以证实。