银杏叶提取物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制

杨 龙，刘春明，王正飞，崔 聪

(1.郑州市第七人民医院心血管外科，河南 郑州 450000；2.河南省胸科医院心血管外科，河南 郑州 450000)

心血管疾病在人群中的发病率和病死率始终位居所有疾病的前3位，是危害全球人类健康的重要疾病[1-2]。目前，药物溶栓及介入治疗等措施使冠状动脉血流再恢复灌注是较为有效的治疗手段。然而，再灌注可能存在溶栓后心律失常和局部出血等心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。MIRI常伴随细胞氧化应激过程，使心肌血管微环境中多种有害产物堆积，诱导心肌细胞发生凋亡和坏死。

银杏叶提取物(ginkgo biloba extract，GBE)的主要成分黄酮及银杏内酯，具有清除氧自由基、促进血管平滑肌舒张作用，对心肌梗死具有重要的防治作用[3-4]。微RNA(microRNA，miRNA)在生物体内可与相应靶基因的3′非编码区特异性结合，进而引起靶基因的降解或抑制其翻译蛋白产物的表达。研究表明，miRNAs可通过靶向细胞存活或凋亡通路中的关键分子，如B淋巴细胞瘤-2凋亡调控因子、热休克蛋白70、磷脂酰肌醇3激酶和去乙酰化酶1等基因影响心肌细胞的生物学功能[5-6]，导致这些基因在MIRI患者的血清及心肌组织中特异性表达[7]，因此，miRNAs可能成为MIRI的早期防治重要生物标志物。因此，本研究通过构建大鼠MIRI模型，观察GBE对MIRI大鼠心肌组织中miRNA表达的影响，以期探讨GBE在MIRI发生、发展过程中的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体级8周龄雄性Sprague Dawley大鼠48只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，出售许可证号：SCXK(京)2019-0006，动物质量合格证编号：1100111911006370，体质量250～300 g，自由饮水摄食，饲养于通风良好、温度和湿度适宜的实验室，12 h/12 h光照昼夜节律。本研究中的所有实验动物操作符合实验动物伦理学委员会的动物实验标准。

1.2 仪器与试剂40 g·L-1多聚甲醛购自上海尚炫生物公司，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，GBE(货号：CP2015)购自绍兴东灵保健食品有限公司，Fast7500实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)仪购自美国ABI公司，miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRcute增强型荧光定量检测试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；BL-420S型生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司，石蜡切片机购自北京六一仪器公司，紫外可见分光光度计购自西安禾普生物科技有限公司，全自动生物化学分析仪购自深圳迈瑞生物电子有限公司，光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组和模型构建48只大鼠常规饲养1周后按随机区组设计原则分为假手术组、MIRI组、低剂量GBE(low-dose GBE，L-GBE)组和高剂量GBE(high-dose GBE，H-GBE)组，每组12只。假手术组和MIRI组大鼠给予2 mL生理盐水灌胃，L-GBE组和H-GBE组大鼠分别给予50、100 mg·kg-1的GBE溶液灌胃，每次给药前12 h对大鼠进行禁食不禁水处理，连续给药7 d，最后一次给药为造模前2 h。MIRI组、L-GBE组和H-GBE组大鼠参照文献[8]采用栓线法制备大鼠MIRI模型：于大鼠胸骨左缘3～4肋间切开胸壁暴露出心脏，将左冠状动脉前降支进行结扎，结扎线由直径2 mm的PE管中穿出。PE管的一端用来阻断冠状动脉血流，另一端采用动脉夹进行固定；以心电图ST段开始呈弓背向上为缺血梗死标志，肉眼可见血管支配区心室肌颜色由苍白变成紫绀色，持续 30 min 后松开结扎线，恢复血流再灌注120 min。假手术组大鼠仅开胸、暴露心脏，不予冠状动脉结扎。造模过程中MIRI组、L-GBE组、H-GBE组大鼠分别死亡3、2、1只。

1.3.2 大鼠心脏功能检测应用生物机能实验系统检测4组大鼠心肌缺血发生前10 min(T0)、缺血后30 min(T1)、缺血再灌注30 min(T2)、缺血再灌注60 min(T3)、缺血再灌注120 min(T4)的心率，并记录T4时J点抬高值。

1.3.3 大鼠心脏组织取材和HE染色正常组大鼠麻醉后采集心脏组织标本，MIRI组、L-GBE组和H-GBE组根据实验需求取大鼠心肌梗死组织约1 cm×1 cm×1 cm，置于40 g·L-1多聚甲醛中固定，用流水冲洗1 h，脱水、透明、浸蜡和包埋后，连续切片并固定；经体积分数100%、95%、90%、85%和80%梯度乙醇及二甲苯浸泡脱蜡后置于苏木精染液中，伊红染液染色后，脱水透明并封片，在光学显微镜下(×200)观察心肌组织形态学变化。其余心脏组织放入液氮中迅速冷冻用于后续基因测序和qRT-PCR检测。

1.3.4 MIRI组和H-GBE组大鼠心肌组织中miRNA测序分别取MIRI组和H-GBE组3只大鼠心肌梗死组织进行miRNA测序。测序平台为Illumina Hiseq 2500，利用R语言edgeR包将各组数据分别计算出各个样本基因的表达量、均值和基因变化倍数(foldchange)，转换为log2(foldchange)后，以P<0.05且log2(foldchange) 的绝对值>1.2为标准，筛选出差异表达基因。

1.3.5 qRT-PCR法检测MIRI组和H-GBE组大鼠心肌组织中差异表达miRNA的相对表达量将MIRI组和H-GBE组大鼠心肌梗死组织加入TRIzol并进行研磨，随后加入200 μL氯仿，反复剧烈摇晃后，室温放置5 min。4 ℃下12 000×g离心15 min，吸取三层匀浆最上层约400 μL无色上清，置于另一无酶离心管内；加500 μL异丙醇，混匀上下摇晃，在室温放置10 min，4 ℃ 下12 000×g离心10 min，将上清弃掉。加体积分数75%乙醇1 mL，上下颠倒后在4 ℃下 7 500×g离心5 min，将上清弃掉。在滤纸上将开口的离心管倒置10 min后，加20 μL的无酶水促使离心管内沉淀溶解；吸取1.0 μL溶解液，在核酸蛋白分析仪上测定RNA浓度。根据A260/A280值，确定是否存在DNA或者蛋白污染。经miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行加尾后，使用miRcute 增强型 miRNA 荧光定量检测试剂盒在Fast7500 qRT-PCR仪进行检测，以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miRNAs的相对表达量。 实验重复3次，取均值。

1.3.6 差异表达miRNAs靶基因预测和信号通路富集分析使用miRwalk数据库(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)对特异性miRNAs进行靶基因预测和功能注释，通过基因本体(gene ontology,GO)和京都基因组百科全书数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)对上述获得的差异表达基因进行生物学过程、细胞组分、分子功能和相关信号通路预测，筛选标准为P<0.05，容错率(false discovery rate，FDR)<5%。

2 结果

2.1 4组大鼠心率和J点抬高值比较结果见表1。4组大鼠T0时心率比较差异无统计学意义(F=6.659，P>0.05)。MIRI组、L-GBE组和H-GBE组大鼠T1、T2、T3、T4时心率显著低于假手术组，J点抬高值显著大于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；L-GBE组和H-GBE组大鼠T1、T2、T3和T4时心率显著高于MIRI组，J点抬高值显著小于MIRI组，差异有统计学意义(P<0.05)；H-GBE组大鼠T1、T2、T3和T4时心率显著高于L-GBE组，J点抬高值显著小于L-GBE组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 4组大鼠心率及J点抬高值比较Tab.1 Comparison of heart rate and J-point elevation value of rats among the four groups

2.2 4组大鼠心肌组织病理形态学变化结果见图1。假手术组大鼠心肌结构完整，细胞间质未见明显炎症浸润和水肿，心肌细胞未发生显著的变性和坏死。MIRI组大鼠心肌组织结构紊乱，心肌细胞肿胀，出现明显的空泡样变性坏死，炎症浸润程度明显增加。与MIRI组相比，H-GBE组和L-GBE组大鼠心肌组织紊乱程度降低，炎症浸润减少，水肿程度降低，H-GBE组大鼠心肌组织损伤程度较L-GBE组更低。

A：假手术组；B：MIRI组；C：L-GBE组；D：H-GBE组。图1 4组大鼠心肌组织病理形态学(HE染色，×200)Fig.1 Pathomorphology of myocardium of rats in the four groups (HE staining,×200)

2.3 MIRI组和H-GBE组大鼠心肌组织中差异表达miRNAs筛选结果结果见图2。MIRI组和H-GBE组大鼠心肌梗死组织共鉴定出1 290个miRNAs，其中miR-144、miR-200b、miR-34、miR-146、miR-21、miR-155和miR-200c呈差异表达。H-GBE组大鼠心肌组织中miR-144、miR-200b显著高于MIRI组，miR-21、miR-34、miR-146、miR-155和miR-200c显著低于MIRI组(P<0.05)。

图2 MIRI组和H-GBE组大鼠心肌组织miRNAs差异表达热图Fig.2 Heatmap of differentially expressed miRNAs in myocardium of rats between the MIRI group and H-GBE group

2.4 MIRI组和H-GBE组大鼠心肌组织差异表达miRNAs相对表达量比较结果见表2。H-GBE组大鼠心肌组织中miR-144、miR-200b相对表达量显著高于MIRI组，miR-34、miR-155、miR-21、miR-146和miR-200c相对表达量显著低于MIRI组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 MIRI组和H-GBE组大鼠心肌组织miRNAs相对表达量比较Tab.2 Comparison of relative expression of miRNAs in myocardium of rats between the MIRI group and H-GBE group

2.5 差异表达miRNAs靶基因预测和信号通路富集分析结果见图3。使用miRwalk数据库对上述7个差异表达miRNAs进行靶基因预测，共富集到3 401个靶基因；对靶基因进行KEGG信号通路分析发现，7个差异表达miRNAs主要参与叉头框O(forkhead Box O，FoxO)信号通路、自噬、Hippo信号通路、轴突导向、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)信号通路、神经营养蛋白、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)等信号通路和生物学过程。

图3 差异表达miRNAs的KEGG信号通路Fig.3 KEGG signaling pathway of differentially expressed miRNAs

3 讨论

全球每年因心血管疾病死亡患者约占全球总死亡人数的1/3，而心肌梗死由于其病情进展迅速，成为心血管疾病防治的重点和难点。目前研究普遍认为，MIRI过程是由多种类型的分子、不同的细胞、多个组织共同参与的一个复杂调控过程[9-10]。随着对心肌缺血再灌注研究的不断深入，目前已基本清楚该过程的发生与炎症浸润、氧化应激损伤、血管内皮细胞缺氧坏死和细胞凋亡等因素有关[11-12]。但尚缺乏参与调控上述生物学过程全面且高效的药物。近年来，GBE被发现在防治心脑血管疾病中具有较高的药用价值。GBE主要药用成分为总黄酮及银杏内酯，其中总黄酮在抗氧化、清除自由基和调控免疫应答等过程具有重要作用，而银杏内酯则可通过活血化瘀改善心血管疾病[13-14]。本研究结果显示，MIRI组、L-GBE 组和H-GBE组大鼠T1、T2、T3、T4时心率显著低于假手术组，J点抬高值显著大于假手术组； L-GBE 组和H-GBE组大鼠T1、T2、T3和T4时心率显著高于MIRI组，J点抬高值显著小于MIRI组；H-GBE 组大鼠T1、T2、T3和T4时HR 显著高于L-GBE组，J点抬高值显著小于L-GBE组。假手术组大鼠心肌结构完整，细胞间质未见明显炎症浸润和水肿，心肌细胞未发生显著的变性和坏死。MIRI组大鼠心肌组织结构紊乱，心肌细胞肿胀，出现明显的空泡样变性坏死，炎症浸润程度明显增加。与MIRI组相比，H-GBE组和L-GBE组大鼠心肌组织紊乱程度降低，炎症浸润减少，水肿程度降低，H-GBE组大鼠心肌组织损伤程度较L-GBE组更低。这一结果说明，MIRI导致了大鼠心功能损伤，GBE可逆转MIRI导致的大鼠心功能损伤，高剂量GBE(100 mg·kg-1)作用更为显著，较为适合GBE对MIRI大鼠模型的药物功能学研究。

miRNA广泛参与心血管疾病的发生、发展。近期大量研究集中关注GBE缓解缺血再灌注过程[15-16]，但研究该过程参与的关键miRNA较少，且缺少GBE干预后心肌组织miRNA变化的全谱性研究。本研究基因测序结果显示，MIRI组和H-GBE组大鼠心肌梗死组织共有1 290个miRNAs表达，其中miR-144、miR-200b、miR-34、miR-155、miR-21、miR-146和miR-200c呈差异表达；利用miRwalk数据库对上述7个差异表达miRNA进行靶基因预测，共富集到 3 401个靶基因，对靶基因进行KEGG信号通路分析发现，7个差异表达miRNA主要参与FoxO信号通路、自噬、Hippo信号通路、轴突导向、TNF信号通路、神经营养蛋白、mTOR信号通路和生物学过程。本研究qRT-PCR检测结果显示，H-GBE组大鼠心肌组织中miR-144相对表达量显著高于MIRI组，说明GBE可能通过增加miR-144的表达对MIRI导致的心功能损伤起保护作用。MiR-200是一个多功能miRNA家族，由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429组成[15]，但其在MIRI中的相关作用尚不清楚。有研究发现，miR-200b和miR-200c在血管内皮细胞和平滑肌细胞中的水平受活性氧介导[16]；本研究结果显示，H-GBE组大鼠心肌组织miR-200b相对表达量显著高于MIRI组，miR-200c相对表达量显著低于MIRI组，提示心肌在缺血再灌注过程中产生的活性氧可能会影响miR-200b和miR-200c的表达，而GBE可能通过提高miR-200b或降低miR-200c的水平抑制MIRI造成的心肌损伤。MiR-21和miR-146可通过靶向蛋白酪氨酸磷酸酶1B，激活caspase-3和caspase-8而抑制MIRI诱导的细胞凋亡，发挥抗凋亡作用[17-18]。本研究结果显示，H-GBE组大鼠心肌组织中miR-21和miR-146 相对表达量显著低于MIRI组，提示GBE可能通过抑制大鼠心肌组织中miR-21和miR-146表达水平促进损伤的心肌细胞凋亡，进而增强心肌组织自我修复，保护心肌组织。miR-34被发现在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中高表达，通过靶向沉默调节蛋白保护MIRI所致的心肌细胞凋亡[19]。MiR-155在MIRI发生、发展过程中可通过促进心肌梗死组织浸润的白细胞释放，在缺血诱导的心肌缺氧条件下可增加活性氧的产生[20-21]。本研究结果显示，H-GBE组大鼠心肌组织中miR-34和miR-155相对表达量显著低于MIRI组，说明GBE可能通过调控miR-34和miR-155控制心肌梗死组织的活性氧水平，进而影响受损的心肌细胞凋亡过程，从而对心功能发挥保护作用。

综上所述，miRNAs在MIRI发生、发展过程中具有重要作用，而GBE可通过影响心肌组织miRNA的表达水平对MIRI起保护作用。本研究只在miRNA水平进行了GBE对大鼠心肌MIRI组织的相关探索，尚缺乏进一步的机制研究。随后的研究可从这些关键miRNA入手，探索GBE保护MIRI的相关机制可能具有重要意义。