多重耐药菌感染肺炎老年患者外周血中微RNA-127-5p水平与辅助性T细胞和调节性T细胞及其细胞因子的相关性

安 阳,王 莉,张俊迪,杨江涛,王 立

(河北燕达医院呼吸与危重症医学科，河北 廊坊 065201)

随着年龄的增长，机体免疫抵抗能力逐渐下降，同时由于呼吸系统防御功能的降低，导致老年人群成为肺部感染的高危人群[1]。老年人肺炎的发生率约为青年人的10倍，在肺炎患者中，约90%的患者为65岁以上老年人，且肺炎已经成为80岁以上老年人死亡的第1大原因[2-3]。随着抗菌药物在临床上的广泛使用，多重耐药菌(multidrug resistance organism,MDRO)所引发的肺炎的发生率逐年升高，MDRO是对3种或3种以上抗菌药物同时呈现耐药性的细菌[4]。MDRO所导致的老年肺炎病情不易控制，病死率极高，成为临床诊疗的重点和难点[5]。微RNA(microRNA，miRNA)是广泛存在于真核细胞生物中的非编码RNA，其长度为21～23个核苷酸，有研究显示，miRNA可靶向调控信使RNA的稳定性及翻译效率，从而参与机体免疫功能的调节[6]。免疫细胞因子γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素(interleukin，IL)-4、IL-7及转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在机体炎症反应阶段发挥着重要作用。基于此，本研究检测了MDRO感染肺炎老年患者外周血中miR-127-5p、辅助性T细胞(helper T cell,Th)和调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)及细胞因子水平，旨在探讨miR-127-5p对MDRO感染肺炎老年患者免疫功能及细胞因子的影响，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年3月至2019年11月河北燕达医院收治的MDRO感染肺炎老年患者57例作为MDRO肺炎组，其中男34例,女23例；年龄60～85(73.28±13.44)岁。选择同期收治的普通肺炎老年患者50例作为肺炎组，其中男29例，女21例；年龄60～86(72.91±14.52)岁。另选择同期行健康体检者50例作为对照组，其中30例，女20例；年龄60～85(72.75±15.21)岁。3组受试者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)MDRO肺炎组和肺炎组患者均经临床、血常规、胸部CT检查、X线胸片以及病原学检查确诊，患者均符合《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018年版)》[7]肺炎诊断标准；(2)3组受试者年龄≥60岁；(3)受试者或其家属自愿签署知情同意书。排除标准：(1)合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病者；(2)入组时使用重组IFN-γ和中性粒细胞集落刺激因子治疗。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法检测外周血中miR-127-5p相对表达量抽取MDRO组和肺炎组患者于确诊后次日及对照组受试者于健康体检当日清晨空腹静脉血5 mL，加入外周血淋巴细胞分离液，然后加入TRIzol置于-80 ℃冰箱备用。采用RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取总RNA，酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)检测RNA浓度，反转录cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)反转录为cDNA。采用qRT-PCR仪对miR-127-5p及内参U6进行扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-127-5p上游引物序列为5′-TCCCACCTGCGGGGTGGAAATT-3′，下游引物序列为5′-TCTAGAGAAATCTTTGAATGCCAAG-3′； U6上游引物序列为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物序列为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。qRT-PCR反应体系：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL。反应条件：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共进行45个循环。以U6为内参基因，采用2-△△Ct法计算miR-127-5p相对表达量。

1.2.2 流式细胞术检测外周血中Th、Treg水平MDRO 组及肺炎组患者于确诊后次日检查，对照组于健康体检当日检查，抽取3组受试者外周静脉血，抗凝处理后，细胞培养板中加入200 μL抗凝全血、1640完全培养基100 μL和 4 μL白细胞刺激剂，混合均匀后于37 ℃下孵育过夜；然后转移至流式管中，使用100 μL 染色缓冲液重悬细胞后加入适量双马来酰亚胺-烯丙基双酚荧光标记表面抗体，室温下避光放置20～30 min。采用BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)检测Th1、Th2、Th17及Treg的数量，严格按照试剂盒使用说明书进行操作。

1.2.3 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清中细胞因子水平抽取各组受试者外周静脉血3 mL，3 000 r·min-1离心10 min后分离血清，将其置于-20 ℃冰箱内保存待测。采用ELISA检测受试者血清中IFN-γ、IL-4、IL-7及TGF-β水平，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 3组受试者外周血中miR-127-5p相对表达量比较结果见表1。对照组、肺炎组、MDRO肺炎组患者外周血中miR-127-5p相对表达量分别为1.271±0.318、 0.884±0.225、0.652±0.197，3组受试者外周血中miR-127-5p相对表达量比较差异有统计学意义(F=67.512，P<0.05)。MDRO肺炎组患者外周血中miR-127-5p相对表达量显著低于肺炎组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；肺炎组患者外周血中miR-127-5p相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 3组受试者外周血中Th、Treg细胞数量比较结果见表1。MDRO肺炎组患者外周血中Th1、Treg数量显著低于肺炎组和对照组，Th2、Th17数量显著高于肺炎组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；肺炎组患者外周血中Th1、Treg细胞数量显著低于对照组，Th2、Th17细胞数量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组受试者外周血中Th、Treg数量比较Tab.1 Comparison of the numbers of Th,Treg in peripheral blood of subjects among the three groups

2.3 3组受试者血清中IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β水平比较结果见表2。MDRO肺炎组患者血清中IFN-γ水平显著低于肺炎组和对照组，IL-4、IL-17及TGF-β水平显著高于肺炎组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；肺炎组患者血清中IFN-γ水平显著低于对照组， IL-4、IL-17及TGF-β水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)

表2 3组受试者血清中IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β水平比较Tab.2 Comparison of the levels of serum IFN-γ，IL-4，IL-17，TGF-β of subjects among the three groups

2.4 MDRO肺炎组患者外周血中miR-127-5p相对表达量与Th、Treg及其细胞因子水平的相关性MDRO肺炎组患者外周血中miR-127-5p相对表达量与外周血中Th1、Treg数量及血清中IFN-γ水平呈显著正相关(r=0.297、0.302、0.331，P<0.05)，与外周血中Th2、Th17数量及血清中IL-4、IL-17、TGF-β水平呈显著负相关(r=-0.311、-0.338、-0.289、-0.347、-0.362，P<0.05)。

3 讨论

MDRO感染是老年人发生重症肺炎的主要原因，患者临床治疗难度大、病死率高，成为学者们关注的焦点[8]。有报道显示，MDRO肺炎患者大多合并多种基础性病变及结构性肺病，患者临床预后较差，可能与机体强烈的炎症反应及免疫功能低下有关[9-10]。miRNA是一种调控真核细胞基因表达的单链小片段RNA，对炎症细胞及炎症介质的表达起调控作用[11]。有研究显示，miRNA主要通过调节Toll样受体以及细胞因子的应答参与先天性免疫调控过程，从而在机体先天性免疫应答、特异性免疫应答中扮演重要角色[12]。谢丹等[13]研究显示，miR-127可通过调控IgG Fcg受体Ⅰ基因表达参与肺部炎症反应过程。王昭君等[14]通过分析重症肺炎患者外周血miRNA差异表达谱，共筛选出43个miRNA表达上调以及113个miRNA表达下调。

本研究结果显示，MDRO肺炎组患者外周血中miR-127-5p相对表达量显著低于肺炎组和对照组，肺炎组患者外周血中miR-127-5p相对表达量显著低于对照组。本研究结果与其他学者[15]的研究结果相似，进一步证实miR-127-5p可能参与肺炎及MDRO肺炎的发生、发展过程，推测miR-127-5p对肺炎的调控作用可能与机体免疫功能调节有关。

T淋巴细胞是参与机体特异性免疫反应的重要免疫性细胞，其中CD4+T淋巴细胞发挥着重要的抗感染作用，而CD4+T淋巴细胞又分为Th和Treg[16]。Th主要包括Th1、Th2、Th17 3个细胞亚群，其中Th1主要分泌IL-2和IFN-γ细胞因子，而IL-2及IFN-γ可激活巨噬细胞吞噬病原体，从而介导细胞免疫反应；Th2主要分泌IL-4细胞因子，IL-4可介导速发型超敏反应，从而参与机体的体液免疫反应过程；Th17与自身免疫性疾病的发生、发展密切相关[17-18]。Th17主要分泌IL-17细胞因子，IL-17细胞因子可诱导活化T细胞，同时促进促炎递质的释放，是一种前炎症细胞因子以及促炎症细胞因子[19]。Treg作为一类调控抗体免疫功能的细胞，可抑制机体过强的免疫反应，Treg主要通过分泌IL-17、TGF-β等来抑制炎症因子的表达，从而维持机体的免疫稳态[20]。本研究结果显示，MDRO肺炎组患者外周血中Th1数量及血清中IFN-γ水平显著低于对照组和肺炎组，外周血中Th2、Th17、Treg及血清中IL-4、IL-17、TGF-β水平显著高于对照组和肺炎组。MDRO患者可能由于Th1所介导的细胞免疫受到明显抑制，导致其不能正常分泌IFN-γ，使吞噬杀伤病原体功能受到抑制；而MDRO肺炎患者Th17占CD4+T细胞比例增加，出现Th17/Treg失衡，从而导致患者炎症反应及组织损伤加重，使肺炎患者病情进一步加重。此外，学者研究认为，Th1、Th17及Treg的功能状态与脑卒中相关性肺炎患者疾病进程及临床转归有一定的相关性[21]。

此外，本研究分析了MDRO肺炎老年患者外周血中miR-127-5p与Th、Treg细胞及其细胞因子水平的相关性，结果显示，MDRO肺炎组患者外周血miR-127-5p相对表达量与Th1、Treg细胞数量及血清中IFN-γ水平呈显著正相关，与外周血中Th2、Th17细胞数量及血清中IL-4、IL-17、TGF-β水平呈显著负相关。提示老年MDRO肺炎患者外周血中miR-127-5p表达与Th、Treg及其相关细胞因子有关。

综上所述，MDRO感染肺炎老年患者外周血miR-127-5p水平异常降低，且miR-127-5p表达水平与Th1、Treg介导的免疫反应有关，值得临床进一步关注。