ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素协同抑菌效应的研究

魏奇 钟鑫荣 龚镁青 张承康 张维瑞 陈美霞 刘盛荣

摘 要：ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素属于天然的食品防腐剂。该研究以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，探究ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素及其复配溶液的抑菌作用。结果表明：ε-聚赖氨酸（45μg/mL）和乳酸链球菌素（312.5μg/mL）复配溶液对大肠杆菌的抑制作用最佳;ε-聚赖氨酸（5μg/mL）和乳酸链球菌素（250μg/mL）复配溶液对金黄色葡萄球菌的抑制作用最佳。Checkerboard分析法表明，乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸抑菌作用具有叠加效应。研究结果可以为ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素在食品防腐中的应用提供理论依据。

关键词：ε-聚赖氨酸;乳酸链球菌素;大肠杆菌;金黄色葡萄球菌;抑菌作用

中图分类号 TS201.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）21-00038-05

Abstract： ε-polylysine and nisin were the natural food preservatives. In this study， Escherichia coli and Staphylococcus aureus were used to evaluate the antibacterial activities of ε-polylysine and nisin. Results showed that the combination of nisin （312.5μg/mL） and ε-polylysine （45μg/mL） could inhibit the growth of Escherichia coli. The combination of nisin （250μg/mL） and ε-polylysine （5μg/mL） could inhibit the growth of Staphylococcus aureus. The Checkerboard method showed that the combination of nisin and ε-polylysine had stronger antibacterial activities than nisin or ε-polylysine. This study could provide beneficial effects on the production of food preservatives.

Key words： ε-polylysine; Nisin; Escherichia coli; Staphylococcus aureus; Antibacterial activity

食品在生產、贮存过程中会出现腐败变质的现象。为了防止食品腐败，食品工业生产上主要是采用防腐效果好的化学防腐剂如苯甲酸、山梨酸等抑制食品中微生物的生长。虽然这些常用的化学防腐剂已经按照国家要求控制在一定的范围内，但仍无法避免化学防腐剂残留物对人体产生的潜在毒副作用，甚至致畸致癌等风险[1]。天然食品防腐剂对人体安全无害且具有抑菌和延长食品保质期的作用。因此，天然无毒副作用的食品防腐剂越来越引起广大消费者的青睐[2-4]。

ε-聚赖氨酸是由许多的赖氨酸组成的天然防腐抑菌剂。聚赖氨酸具有广谱抗菌的作用，能够被生物降解，具有巨大的商业潜力[5]。ε-聚赖氨酸在人体中能够直接降解成赖氨酸，对人体无毒无害，是一种天然的生物防腐剂[6，7]。研究表明，ε-聚赖氨酸能够使菌体细胞膜的结构发生变化，破坏细菌的正常生理代谢系统，从而起到杀死细菌的作用[8]。ε-聚赖氨酸能够作用于酶或者功能蛋白，影响蛋白质的合成和正常生理代谢，最终破坏细胞的功能，导致细胞死亡[9]。乳酸链球菌素是由乳酸乳球菌和乳链球菌所产生的多肽物质，是一种对健康无害的天然食品防腐剂。乳酸链球菌素对大多数的革兰氏阳性细菌生长和繁殖（金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等）具有抑制作用，尤其对产生孢子的革兰氏阳性细菌的抑制效果显著。乳酸链球菌素进入机体内后，能够被水解，不会引起机体肠道菌群的紊乱，也不会产生抗药性，对食品的色、香、味、口感等无不良影响[10-14]。因此，乳酸链球菌素是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂，可应用于乳制品、罐头、肉制品和饮料等食品行业。乳酸链球菌素的抑菌作用主要使细菌的细胞膜产生孔洞，抑制革兰氏阳性菌细菌细胞壁合成，细胞膜的通透性发生改变，细胞外的水分子流入细胞内部，细胞内部的小分子物质流出，最终导致细菌死亡[15-18]。目前，乳酸链球菌素已广泛应用于乳制品和肉制品等方面，达到抑制芽孢杆菌孢子生长，防止食品腐败，延长食品保质期，减少化学防腐剂使用量的效果。因此，乳酸链球菌素作为天然高效的保鲜剂，可以保证食品质量并且延长食品的贮藏期。

复合保鲜方法是利用不同保鲜技术的协同效果，降低防腐剂添加剂量的使用量，具有良好的应用前景。天然食品防腐剂的复配应用，有助于提高防腐剂的保鲜效果，增加抑菌谱，减少用量而降低成本[19]。本试验以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，采用琼脂扩散法和微量稀释法来测定乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸及其复配溶液的最低抑菌浓度，应用Checkerboard分析法，探究乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸协同效应，旨在了解ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素及其复配溶液的抑菌作用，为ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素在食品工业上的科学复配应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 菌种 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli），均为宁德师范学院微生物室提供。

1.1.2 试剂 ε-聚赖氨酸，乳酸链球菌素，食品级，浙江新银象生物工程有限公司;营养琼脂，营养肉汤，广州环凯微生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备 DHP-9272A DHP-9272A，上海飞越实验仪器有限公司;SW-CJ-2D净化工作台，上海博迅实业有限公司;YXQ-SG46-280S全自动高压灭菌锅，上海博讯实业有限公司;DHG-9070A鼓风干燥箱，上海飞越实验仪器有限公司;THZ-100恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司;YP802N电子天平，上海精密科学仪器有限公司;YC-300L数控低温保存箱，中科美菱低温科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 溶剂配制 2mg/mL ε-聚赖氨酸溶液制备：取0.2g ε-聚赖氨酸，用去离子水溶解，定容至100mL。2mg/mL乳酸链球菌素溶液制备：取0.2g乳酸链球菌素，用冰醋酸（2%）水溶液溶解，定容至100mL。

1.3.2 培养基配制 营养琼脂培养基的配制：称取营养琼脂干粉（33g）加入1L蒸馏水，高温高压灭菌（121℃，15min）。营养肉汤培养基的配制：称取营养肉汤干粉（18g）加入1L蒸馏水，高温高压灭菌（121℃，15min）。

1.3.3 菌液制備 在超净工作台中，分别取上述少量活化后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，接种至30mL营养肉汤培养基中于恒温摇床中培养24h（150r/min，35℃）。

1.3.4 菌种活化 在试验的前1d，用无菌接菌环挑取营养琼脂平板上的大肠杆菌（金黄色葡萄球菌），装于含10mL营养肉汤的无菌离心管中，置于37℃恒温振荡箱中培养20h，使大肠杆菌（金黄色葡萄球菌）恢复生长。

1.3.5 琼脂扩散法 将活化后的菌悬液离心（2500r/min，15min），倾去废液，加入10mL无菌生理盐水混匀，再离心10min，用5mL无菌生理盐水溶解沉淀。将菌悬液在装有无菌生理盐水的试管中连续梯度稀释，104 CFU/mL的菌悬液备用。吸取1mL制备好的菌悬液于无菌的培养皿中，将琼脂培养基倒入培养皿中，每个培养基20mL，摇匀，凝固后用7mm打孔器打6个孔。分别加入乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸溶液和复配溶液，以无菌水为空白对照。在37℃的生化培养箱20h后观察，并记录抑菌圈大小。

1.3.6 最小抑菌浓度的测定 96孔板中加入100μL ε-聚赖氨酸溶液（或乳酸链球菌素溶液）和100μL菌浓度为106 CFU/mL的大肠杆菌（或金黄色葡萄球菌）。24h后测定最小抑菌浓度。表1为ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素溶液的浓度。

1.3.7 Checkerboard测试 乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸复配溶液的浓度如表2所示。

1.3.8 Checkerboard法计算FICI值 采用Checkerboard法获得FICI值，从而评估乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸相互抑菌作用[20，21]。FICI计算公式如下：

FICI=乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸复配溶液MIC/乳酸链球菌素MIC+乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸复配溶液MIC/ε-聚赖氨酸MIC。

协同作用（0.5≤FICI）;叠加作用（0.52）。

2 结果与分析

2.1 乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸的抑菌活性 乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径测量结果如表3所示。由表3可知，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径随着乳酸链球菌菌素浓度的增加而增加，而乳酸链球菌素对大肠杆菌无明显的抑制作用。ε-聚赖氨酸大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径随着浓度的增加而增加，ε-聚赖氨酸浓度越高抑菌效果越好。

乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸复配溶液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径测量结果如表4所示。由表4可知，ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素复配溶液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径大于相同浓度下单独使用ε-聚赖氨酸或乳酸链球菌素的抑菌圈直径。由此可知，ε-聚赖氨酸与乳酸链球菌素的复配溶液可以增强抑菌效果，复配溶液可以发挥各自的优点，并且弥补乳酸链球菌素无法抑制革兰氏阴性菌的弱点，从而扩展复配溶液的抑菌谱、增强其抑菌作用。

2.2 ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素的最小抑菌浓度 由表5可知，ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为25μg/mL;ε-聚赖氨酸对大肠杆菌的最小抑菌浓度为50μg/mL。乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为250μg/mL;乳酸链球菌素对大肠杆菌没有呈现出抑制作用。由此可知，ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度小于乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度。

2.3 乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸复配溶液对金黄色葡萄球菌的影响 采用Checkerboard方法评价乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸的复配溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果，并根据FICI指数探究乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸之间的相互作用的类型。由表6可知，当ε-聚赖氨酸浓度相同时，乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌的抑制作用随着乳酸链球菌素浓度的增加而增强。当时间为24、48和72h时，ε-聚赖氨酸（5μg/mL）和乳酸链球菌素（250μg/mL）复配溶液可以有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，FICI指数为1.2（0.005/0.025+0.25/0.25=1.2，1

2.4 乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸复配溶液对大肠杆菌的影响 由表7可知，当时间为24h，30μg/mL的ε-聚赖氨酸和250μg/mL的乳酸链球菌素复配溶液能够抑制大肠杆菌的生长，FICI值为0.6，提示乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸复配溶液对大肠杆菌均具有叠加抑菌的作用（0.5

3 讨论

乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸是天然食品防腐抑菌剂，具有较好的抑菌和延长食品贮藏期的作用。ε-聚赖氨酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有抑菌活性其抑菌谱较广。乳酸链球菌素抑菌谱较窄，对大肠杆菌无明显的抑制作用。两者的复配溶液，对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，且增强了对大肠杆菌的抑菌效果[22-24]。因此，开发乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸复合保鲜剂对于提高食品品质和延长食品贮藏期具有十分重要的意义。

利用琼脂扩散法研究ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素单独和复配使用的抑菌效果，研究结果表明，添加的抑菌剂浓度越高，其抑菌效果越好;ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素复配溶液的抑菌效果优于单独使用这2种抑菌剂。ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为25μg/mL;ε-聚赖氨酸对大肠杆菌的最小抑菌浓度为50μg/mL。乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为250μg/mL;乳酸链球菌素对大肠杆菌未呈现出抑制作用。ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素复配溶液对大肠杆菌具有协同抑菌的作用，该研究结果与刘梅等[25]的研究结果相一致。通过研究乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸的复配溶液的抑菌效果，不仅减少了防腐剂使用量，而且拓宽了乳酸链球菌素的抑菌谱，研究结果为二者在天然食品防腐剂中的配合应用提供了理论参考。

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（责编：张宏民）