miR-29a基于BMP2/Runx2对肋骨骨折大鼠的干预作用*

张秀燕，王 强，孙晓娟，田 乐，高 蕾，王海滨，高书军△

（张家口市第二医院 1.手麻科；2.骨科，张家口 075000）

肋骨骨折是钝性胸外伤后最常见的损伤，约占所有钝性胸外伤人群的50%[1]。肋骨骨折可增加患者肺部感染和死亡的风险，尤其是在老年人群中[2]。过去的几十年中，在肋骨骨折患者的护理方面取得了巨大的进步，但患者的预后仍然很差[3]，因此亟待研发出新的治疗策略。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是TGF-β超家族成员，能够刺激间充质骨祖细胞向成骨细胞成熟[4]。矮小相关转录因子2 (runt-related transcription factor 2，Runx2)，也称为核心结合因子α 亚基1（core-binding factor subunit alpha-1，CBF-alpha-1），由Runx2 基因编码，Runx2 是调控成骨细胞分化的关键转录因子[5-6]。BMP2和Runx2转录因子均能够刺激成骨细胞分化和骨形成[1]。有文献报道，BMP2可以通过激活Smad 蛋白来刺激包括Runx2 在内的许多靶基因的表达而发挥作用[7]。此外，Runx2通过直接结合靶基因中的增强子区域来诱导成骨细胞特异性基因表达[1]。

miR-29 家族是一种骨骼和肌肉发育密切相关的miRNA，能够调控成骨细胞的增殖和分化[8]，由miR-29a、miR-29b 和miR-29c 组成。研究发现，miR-29b-3p通过靶向调控BMP1抑制骨折后的愈合过程[9-10]。本研究通过构建大鼠肋骨骨折，探讨miR-29对BMP2/Runx2的调控作用及其对骨折愈合的影响，为促进临床骨折愈合提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只10周龄SPF级雄性SD大鼠，体重（200±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2014-0001。

1.2 肋骨骨折大鼠模型的建立与动物分组 异氟烷麻醉大鼠，取左侧卧位，扪及第六肋骨，分层切开皮肤、皮下组织和肌肉，剥离骨膜，显露肋骨并横向剪断，使肋骨自由移动，对位分层缝合[11]。术后1 d，将大鼠随机分为对照组和miR-29 组，每组20 只。miR-29 组在骨折断端，使用微量注射器注射30 μL miR-29 mimic（购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，终浓度1.67 μg/μL，溶于生理盐水），对照组注射等量生理盐水。

1.3 Micro-CT 扫描 造模14 d、28 d 后，每组分别处死10 只大鼠，X 线片观察大鼠肋骨愈合情况。Micro-CT扫描检测各组肋骨显微结构参数，扫描条件为：图像矩阵为2 048×2 048，整合时间为200 ms，能量/强度为70 kVp、114 μA、8 W，以0°旋转，进行扫描。扫描结束后用Micro-CT 自带的软件进行定量分析，指标包括骨密度、骨矿物质含量及骨骼体积比。

1.4 Western blotting法检测Runx2和BMP2蛋白表达 取大鼠肋骨骨痂组织，加入组织裂解液充分研磨，离心，取上清，BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液（1∶4）煮沸使蛋白变性，每孔加入30 μg样品或5 μL Marker 进行SDS-PAGE，浓缩胶电压75 V，30 min，分离胶电压120 V，60 min；转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，洗膜；一抗Runx2、BMP2、β-actin（均1∶1 000，Abcam，英国）4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜；山羊抗兔IgG 二抗（1∶3 000，Abcam，英国）室温孵育30 min，洗膜；ECL 显色，曝光。采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量

1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测Runx2和BMP2 mRNA 相对表达量 Trizol 法提取肋骨骨痂组织样本总RNA，nanodrop 测定RNA 浓度，逆转录为cDNA，进行PCR 扩增。PCR 反应体系为20 μL：上游和下游引物各(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA 2.0 μL，SYBRTM Premix Dimer Eraser(2×)10 μL，ddH2O 4.0 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火、延伸各20 s，共40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量，引物序列如下，BMP2 上游：5'-TGCACCAAGATGAACACAGC-3'，下游：5'-GTGCCACGATCCAGTCATTC-3'；Runx2 上游：5'-CCATAACGGTCTTCACAAATCCT-3'，下游：5'-TCTGTCTGTGCCTTCTTGGTTC-3'；miR-29a上游：5'-ACAGACTCATTCCATTGTGC-3'，下游：5'-CCACATGCAATTCAGGTCAG-3'；β-actin上游：5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，下游：5'-TACATGGCTGGGGTGTTGA-3'，U6 上游：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，下游5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.6 统计学方法 采用SPSS 27.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示。组内和组间进行两两比较时，若满足正态分布且方差齐性采用Student'st检验；若服从正态分布但方差不齐，则用Welch'st-test；若非正态分布，则用Mann-WhitneyUtest，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠一般情况比较 miR-29组20只大鼠均成活并造模成功；对照组20 只大鼠均造模成功，未发生死亡。所有大鼠术后第1 天活动自如，进食及饮水正常。术后1 周伤口局部红肿逐渐消退，无渗液。

2.2 骨组织愈合情况比较 X线片显示，自14 d开始，两组均有骨痂开始形成，至28 d骨痂塑形改建，说明随着时间推移两组的骨折均有不同程度的愈合。两组X线片图像显示，14 d时miR-29组骨痂形成较对照组明显增加。随时间推移两组骨折线均逐渐变模糊，28 d时对照组骨痂塑形完成，骨干趋于正常，骨密度均匀，而miR-29 组愈合情况明显优于对照组（图1）。此外，Micro-CT结果显示，两组大鼠的骨密度、骨矿物质含量及骨骼体积比均随时间逐渐增加（P＜0.05），与对照组相比，miR-29 组骨密度、骨矿物质含量及骨骼体积比均显著增加（P＜0.05），见图2。

图1 不同时间点大鼠胸部X线片

图2 不同时间点大鼠肋骨微结构变化

2.3 两组不同时间Runx2 和BMP2 mRNA 相对表达量比较 与对照组相比，miR-29 组miR-29、Runx2 和BMP2 mRNA 相对表达量均明显升高（均P＜0.05），两组肋骨骨折28 d 时miR-29、Runx2 和BMP2 mRNA 相对表达量均较14 d 时明显下降（均P＜0.05），见图3。

图3 两组不同时间miR-29、Runx2及BMP2 mRNA相对表达量比较

2.4 两组Runx2 及BMP2 蛋白表达水平比较 与对照组比较，miR-29 组Runx2 及BMP2 蛋白表达量均明显升高（均P＜0.05），两组肋骨骨折28 d 时Runx2 和BMP2 蛋白表达量均较14 d 时明显下降（均P＜0.05），见图4。

图4 不同时间点大鼠肋骨中Runx2及BMP2的蛋白量变化

3 讨论

骨形成是指未分化的前体细胞在损伤发生后趋化集中到损伤部位，并在Smad蛋白、BMP家族等转录因子的刺激作用下分化为成骨细胞并合成胶原，最终形成新的骨组织的过程。成骨分化过程受到诸多转录因子起的调控，Runx2 和BMP2 作为最主要的成骨分化转录因子，调控多种成骨标志性基因的表达，是骨形成中的关键信号通路[12-13]。已有文献报道，BMP2可以通过激活Smad蛋白和其他信号转导途径来刺激包括Runx2在内的许多靶基因的表达而发挥作用，其具体机制为，BMP 信号传导首先通过配体与Ⅰ型和Ⅱ型BMP受体结合而激活，并由Smad 经典通路或者丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径进行转导[14-15]。本研究结果表明，肋骨骨折后BMP2、Runx2信号通路激活，诱导前成骨细胞成骨分化和刺激成骨细胞增殖，从而促进骨痂形成和基质矿化。此外，本研究结果显示，肋骨骨折28 d 时两组BMP2、Runx2表达量均明显下调（P＜0.05），表明在骨折愈合末期，骨痂形成和基质矿化已趋于完成，BMP2/Runx2信号通路逐渐恢复非激活水平。

miRNA是在植物、动物和某些病毒中普遍存在的单链非编码RNA分子，长度约20个核苷酸，主要参与了基因的转录后沉默，被发现在多种骨科疾病过程中起到核心调控作用[16]。其中，miR-29家族是研究最为广泛的miRNA之一。miR-29家族由miR-29a、miR-29b 和miR-29c 组成，miR-29a 主要分布于细胞质，而miR-29b 和miR-29c 主要分布于细胞核中，发挥不同的生理病理功能[17-18]。Zhang等[9]发现，miR-29b-3p 结合于BMP1 的3'UTR 区从而降低其mRNA 水平，抑制骨髓间充质干细胞的成熟和分化；另一项研究显示，miR-29b-3p 可以促进骨痂矿物质沉积、提高骨小梁的体积，因而有利于骨折的愈合[19]。miR-29在骨折愈合中的作用十分复杂，其干预时期和所表达的组织细胞不同，在骨折愈合中可能会产生不同的作用。此外，在脆性骨折中，miR-29a和miR-29b在患者的血液中低表达，且与骨密度呈正相关关系[20]。在破骨细胞中特异表达miR-29a，可以抑制核因子κB 受体活化因子配体（RANKL）和趋化因子CXCL12的表达，从而抑制破骨细胞的分化成熟，有利于骨骼中矿物质的沉积和骨小梁的形成[21]。最后，miR-29a 还可以通过ERK/MAPK 通过激活Wnt/β-catenin 信号通路，从而促进成骨细胞的分化成熟；另一方面，miR-29a受Wnt/βcatenin 通路的调控，在其激活后高表达，因而miR-29a 可与Wnt/β-catenin 形 成正反馈调节 环路[22-23]。但miR-29a 与BMP2/Runx2 的crosstalk在肋骨骨折中的作用还不明确。本研究通过局部过表达miR-29a，发现其能促进BMP2/Runx2 的表达和蛋白量，从而促进骨痂形成、提高骨密度而发挥促进骨折愈合的作用。

综上，miR-29a能够促进大鼠肋骨骨折的恢复，其作用机制与BMP2/Runx2 通路有关，但其具体作用靶点有待进一步的研究。