糖肾煎对糖尿病肾病大鼠足细胞自噬及mTOR/P70S6K通路的影响研究*

牛晓静，张利芳，赵 静，叶寒露，晏 玲

（武汉市中医医院内分泌科，武汉 430014）

糖尿病肾病是目前临床中常见的并发症之一，近年来流行病学研究表明，约有21.3%的糖尿病患者并发肾脏疾病，并表现出逐年升高趋势[1]。糖尿病肾病的发生发展与高血糖及肾脏血流量等多种因素密切相关，并以血尿、蛋白尿等为主要临床特征，然而，目前临床中对于糖尿病肾病的治疗尚缺乏特异性药物，现有药物只能缓解患者的部分症状[2]，所以对于糖尿病肾病治疗药物的研发仍是目前的工作重点。mTOR/P70S6K 通路作为与细胞增殖分化密切相关的重要信号通路，近年来研究发现mTOR/P70S6K 通路的异常激活与糖尿病肾病及足细胞损伤密切相关[3]。糖肾煎是以中医理论为指导的中药方剂，现代研究表明其对于糖尿病肾病具有显著的改善作用[4-5]，然而其对足细胞自噬的影响及作用机制目前尚未见明确报道。本文通过研究糖肾煎对糖尿病肾病大鼠足细胞自噬及mTOR/P70S6K通路的调节作用，为糖肾煎的药理作用研究提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

BS-420 全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；3-30KS 高速冷冻台式离心机(德国Sigma 公司)；Gel Doc EZ 凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)；CKX41-F32FL荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS 公司)；MK3 酶标仪(芬兰雷勃诊断有限公司)；ACCU-CHEK Active 血糖仪(瑞士ROCHE公司)。

1.2 药品及试剂

糖肾煎由生黄芪(批号181109)30 g，太子参(批号191011)及五味子(批号190708)各20 g，生地黄(批号181223)、山 药(批号190526)、山茱萸(批号190817)、茯苓(批号190928)、丹皮(批号191101)、赤芍(批号190708)、三七(批号190522)各10 g 组成(北京同仁堂股份有限公司)，将药材置于1 500 mL蒸馏水中浸泡2 h，煎煮1 h，过滤，将药材残渣置于1 000 mL蒸馏水中煎煮40 min，过滤，合并两次滤液，蒸发浓缩，制成每毫升含生药2.5 g的制剂；二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，批号20191017)；STZ(美国Sigma 公司，货号S0130)；尿蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C035-2-1)；高糖高脂饲料(含蔗糖10%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇1.5%、胆酸钠0.5%、全价饲料68%)(江苏省协同医药生物工程有限公司，货号1019008)；血清肌酐及血清尿素氮(北京索莱宝科技有限公司，货号分别为BC4910、BC1530)；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒，苏木精—伊红(HE)染色试剂盒，p-mTOR兔多克隆抗体，mTOR 兔单克隆抗体，免疫荧光染色试剂盒—抗兔Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647，超敏ECL 化学发光液(碧云天生物科技有限公司，货号分别为S0103、S0131S、S0116、C0105M、AF5869、AF1648、P0176、P0180、P0018M)；LC3、Synaptopodin、p-P70S6K、P70S6K 兔多克隆抗体(赛默飞世尔科技有限公司，货号分别为PA5-22729、PA5-97078、PA5-17884、PA5-17883)。

1.3 实验动物

SD 大鼠41 只，购自三峡大学(合格证NO.42010200003408)，SPF 级，21 只雄性，20 只雌性，8 周龄，体重200～250 g，饲养于实验动物房，温度为22～26 ℃，相对湿度50%～70%的饲养条件下进行饲养，人工光照明暗各12 h。

1.4 造模、分组及给药

大鼠按照随机数字表法分为空白对照组(6 只)及造模组(35只)，空白对照组给予普通饲料喂养，造模组参照文献[6]方法，采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射STZ法建立糖尿病肾病大鼠模型，具体方法：给予大鼠高糖高脂饲料喂养4 周后，按照35 mg/kg一次性腹腔注射给予1%的STZ 溶液，继续以高糖高脂饲料喂养1 周后尾静脉采血，使用血糖仪测定大鼠随机血糖，并随机取5 只大鼠进行肾组织病理学检查，以大鼠随机血糖≥16.7 mmol/L且肾组织出现明显病理学改变视为糖尿病肾病大鼠造模成功。将剩余造模组大鼠随机分为模型组，糖肾煎低、中、高剂量组及二甲双胍组，每组6 只。糖肾煎低、中、高剂量组分别按照5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg[7](以生药含量计)的剂量灌胃给予大鼠糖肾煎，二甲双胍组按照100 mg/kg[8]灌胃给予大鼠二甲双胍，空白对照组及模型组灌胃给予生理盐水，所有组别给药 1 次/d，连续给药16 周[7]。末次给药结束24 h后，连续24 h 收集各组大鼠尿液，并使用尿蛋白检测试剂盒测定各组大鼠24 h尿蛋白量，随后进行后续实验。

1.5 空腹血糖及糖化血红蛋白水平的测定

各组大鼠禁食12 h 后，眼眶静脉丛取血，使用全自动生化分析仪测定大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平。

1.6 血清肌酐及血清尿素氮水平的测定

腹腔注射给予大鼠30 mg/kg 的戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉后，取仰卧位，腹主动脉取血至干净离心管中，室温静置1 h，8 000 r/min，在4 ℃条件下离心10 min，取上清液，使用酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒测定各组大鼠血清肌酐及尿素氮水平。

1.7 肾组织SOD、MDA及T-AOC水平的测定

颈椎脱臼法处死大鼠后分离肾组织，加入4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液研磨匀浆后，8 000 r/min，4 ℃条件下离心15 min，取上清液，按照试剂盒方法测定大鼠肾组织SOD、MDA及T-AOC水平。

1.8 HE染色法检查肾组织病理学变化

取大鼠肾组织，在4%中性甲醛中固定24 h 后，在石蜡包埋机包埋后，使用石蜡切片机进行5 μm切片，经二甲苯脱蜡及梯度乙醇水化后，使用HE染色试剂盒进行常规染色，并在显微镜下对各组大鼠肾组织病理学进行盲法观察。

1.9 免疫荧光法测定足细胞Synaptopodin 及LC3水平

取大鼠肾组织石蜡切片，经脱蜡、水化及抗原修复后，使用固定液在4 ℃条件下固定过夜，洗涤液洗3次，5 min/次，封闭液封闭60 min，将切片与Synaptopodin 及LC3 兔多克隆抗体(1∶500 稀释)4 ℃孵育过夜，洗涤液洗3 次，5 min/次，加入Alexa Fluor 488 和Alexa Fluor 647 抗兔二抗(1∶1 000 稀释)37 ℃避光孵育1 h，用DAPI 对细胞核进行复染，滴加抗荧光淬灭剂，在荧光显微镜下进行观察拍照，使用ImageJ Pro 1.51对荧光强度进行分析。

1.10 免疫印记法(western blotting)检测肾组织pmTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K蛋白水平

取大鼠肾组织，置于含有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的组织裂解液中，研磨匀浆后，在4 ℃条件下，以12 000 r/min，离心10 min，取上清液，使用BCA 蛋白质测定试剂盒测定总蛋白浓度。取相当于40 μg 蛋白的匀浆液，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到聚偏氟乙烯膜上，使用封闭液在室温条件下封闭2 h 后，分别使用p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K 及GAPDH 抗体(1∶1 000 倍稀释)在4 ℃条件下孵育过夜，使用TBST清洗3次，5 min/次，再使用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶2 000倍稀释)室温孵育1 h，再次使用TBST 清洗3 次，滴加超敏ECL 化学发光液检测试剂在凝胶成像系统中成像后，使用ImageJ 1.4.0软件对各蛋白表达量进行定量分析。

1.11 统计学方法

所有数据均通过SPSS 26.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示。多组间比较采用单向方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖肾煎对糖尿病大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，糖肾煎各剂量组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平显著降低，并呈剂量依赖性(P＜0.05)，见表1。

表1 大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平比较，n=6

表1 大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平比较，n=6

与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与糖肾煎低剂量组比较，cP＜0.05；与糖肾煎中剂量组比较，dP＜0.05。

2.2 糖肾煎对糖尿病大鼠24 h尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠24 h 尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，糖肾煎各剂量组24 h 尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平显著降低，并呈剂量依赖性(P＜0.05)，见表2。

表2 大鼠24 h尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平比较，n=6

表2 大鼠24 h尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平比较，n=6

与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与糖肾煎低剂量组比较，cP＜0.05；与糖肾煎中剂量组比较，dP＜0.05。

2.3 糖肾煎对糖尿病大鼠肾组织SOD、MDA 及TAOC水平的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠肾组织SOD及T-AOC 水平显著降低(P＜0.05)，MDA 水平显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，糖肾煎各剂量组肾组织SOD 及T-AOC 水平显著升高(P＜0.05)，MDA 水平显著降低，并呈剂量依赖性(P＜0.05)，见表3。

表3 大鼠肾组织SOD、MDA及T-AOC水平比较，n=6

表3 大鼠肾组织SOD、MDA及T-AOC水平比较，n=6

与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与糖肾煎低剂量组比较，cP＜0.05；与糖肾煎中剂量组比较，dP＜0.05。

2.4 糖肾煎对糖尿病大鼠肾组织病理学的影响

空白对照组大鼠肾组织细胞结构正常，无明显病理学变化；与空白对照组比较，模型组大鼠肾组织系膜基质增生，炎症细胞聚集；与模型组比较，糖肾煎各剂量组大鼠肾组织系膜增生减轻，炎症细胞聚集明显减少，二甲双胍组大鼠肾组织炎症浸润明显减轻，见图1。

图1 大鼠肾组织病理学检查结果(HE，×400)

2.5 糖肾煎对糖尿病大鼠足细胞Synaptopodin 及LC3水平的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠足细胞Synaptopodin及LC3荧光强度显著降低(P＜0.05)；与模型组比较，糖肾煎各剂量组足细胞Synaptopodin 及LC3荧光强度显著升高，并呈剂量依赖性(P＜0.05)，见图2。

图2 大鼠足细胞Synaptopodin及LC3水平比较

2.6 糖肾煎对糖尿病大鼠肾组织p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K蛋白水平的影响

空白对照组比较，模型组大鼠肾组织p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K 水平显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，糖肾煎各剂量组肾组织p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K水平显著降低，并呈剂量依赖性(P＜0.05)，见图3。

图3 大鼠肾组织p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K 蛋白水平比较

3 讨论

糖尿病肾病是由于长期血糖水平升高及糖代谢紊乱造成的肾组织病理性改变。近年来糖尿病肾病在我国的发病率逐年升高，是导致终末期肾病的主要病因之一[9]。糖尿病肾病的发生与血糖水平升高、遗传因素及肾脏血流动力学异常等因素密切相关，如不及时干预可能会进展为终末期肾衰竭等严重肾病，甚至危及患者生命。足细胞损伤是由于肾组织病理性改变过程中出现的足细胞功能异常，导致肾小球滤过率降低及肾小管上皮细胞损伤等病理改变，进而出现血尿、蛋白尿及全身水肿等典型病理特征[10]。目前，临床中对于糖尿病肾病的治疗常采用控制血糖、血压等药物手段，终末期肾病患者则采用替代治疗手段。然而，上述治疗手段表现出有效率低、不良反应多等缺点，且严重影响患者的生活质量。所以，对于糖尿病肾病治疗药物的开发是当前的主要任务之一。

糖肾煎是基于中医学理论，由生黄芪、太子参、生地、山药、山茱萸、茯苓、丹皮、五味子、赤芍、三七等传统中药材组成的中药成方制剂，现代医学研究发现其对于糖尿病肾病具有显著效果。其中，胡爱民等[11]研究发现，糖肾煎联合贝那普利能够显著调节2 型糖尿病肾病患者血糖及血脂代谢，降低患者尿蛋白量，进而缓解糖尿病肾病患者疾病状态；管炜等[12]研究表明，糖肾煎联合羟苯磺酸钙能够通过降低糖尿病肾病患者血肌酐及血清尿素氮水平进而改善患者肾功能；晏玲等[13]给予糖尿病肾病大鼠糖肾煎后发现，糖肾煎能够通过降低大鼠胱抑素c及血、尿β2微球蛋白进而改善大鼠肾功能。由此表明，糖肾煎在治疗糖尿病肾病方面具有较大潜力。

24 h 尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平是反应肾组织功能的常用指标，尿蛋白量增加提示肾小球滤过率降低，血清肌酐及血清尿素氮水平提示肾功能下降[14-15]；本实验结果表明，与空白对照组比较，模型组大鼠24 h 尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平均显著升高，与模型组比较，糖肾煎各剂量组大鼠24 h尿蛋白量、血清肌酐及血清尿素氮水平均明显降低，提示糖肾煎能够呈剂量依赖性改善糖尿病肾病大鼠肾功能，修复大鼠肾损伤，减缓大鼠疾病进展；肾组织SOD、MDA及T-AOC水平是反应肾组织氧化应激损伤的修复能力的重要指标，研究表明，糖尿病大鼠肾组织MDA水平升高，SOD及T-AOC 水平降低均会导致糖尿病大鼠肾组织损伤加重，并诱导足细胞损伤[16]；本实验结果表明，与空白对照组比较，糖尿病肾病模型大鼠肾组织MDA水平升高，SOD 及T-AOC 水平降低，而给予大鼠不同剂量的糖肾煎，大鼠MDA 水平降低，SOD 及TAOC水平升高，提示糖肾煎能够呈剂量依赖性改善糖尿病肾病大鼠氧化应激损伤，提高肾组织自我修复能力，恢复大鼠足细胞功能，并具有一定的剂量依赖趋势。

研究表明，足细胞自噬与糖尿病肾病的进展密切相关，同时，足细胞自噬水平降低会导致肾组织对氧化应激损伤的自我修复及调节能力降低，加重肾组织损伤[17]。Synaptopodin 是一种与肌动蛋白微丝偶联的蛋白，在动物体内表达于肾小球的足细胞和后脑的突触内[18]。LC3 是与细胞自噬相关的蛋白，研究表明其水平降低是细胞自噬水平降低的表现[19]。本研究发现，与空白对照组比较，模型组大鼠Synaptopodin及LC3荧光强度显著降低提示足细胞数目及足细胞自噬水平均显著降低，给予大鼠不同剂量的糖肾煎后，大鼠Synaptopodin 及LC3 荧光强度显著升高，并呈剂量依赖性，提示糖肾煎能够升高糖尿病肾病大鼠足细胞数量及足细胞自噬水平，进而修复足细胞抗氧化应激损伤功能。

mTOR/P70S6K 是近年来发现的与糖尿病肾病及足细胞损伤密切相关的信号通路。王新慧等[20]研究发现，mTOR 及P70S6K 磷酸化水平升高与足细胞损伤密切相关，抑制mTOR 及P70S6K 磷酸化水平则能够改善足细胞自噬，修复足细胞损伤；詹慧芳等[21]报道了雷帕霉素能够抑制mTOR 及P70S6K的磷酸化，进而激活足细胞自噬并改善其损伤状态；杜俊杰等[22]研究表明，mTOR通路的异常激活会抑制足细胞自噬，而抑制mTOR的磷酸化水平则能够显著提高足细胞自噬水平，修复足细胞损伤。由此可见，mTOR/P70S6K 通路在足细胞自噬的调节过程中起到重要作用。本实验结果表明，与空白对照组比较，模型组大鼠肾组织p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K 水平显著升高；与模型组比较，糖肾煎各剂量组及二甲双胍组肾组织p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K水平显著降低，提示糖肾煎能够呈剂量依赖性显著降低mTOR/P70S6K通路的磷酸化水平，进而修复大鼠肾足细胞损伤，调节足细胞自噬，改善大鼠肾功能，进而改善糖尿病肾病大鼠疾病转归。

综上所述，糖肾煎能够显著改善糖尿病肾病大鼠肾功能，修复足细胞损伤，调节足细胞自噬水平，其机制可能与调节mTOR/P70S6K通路有关。