药用植物千层塔的基原物种及研究进展

陈思思 张梦华 王锦秀 张宪春

摘 要：  清代《植物名实图考》中记载的传统草药千层塔，之前被考证为石松科（Lycopodiaceae）石杉属（Huperzia Bernh）植物蛇足石杉（Huperzia serrata）。目前药学研究从中分离出的石杉碱甲，能够高效、高选择、可逆地抑制乙酰胆碱酯酶，减少乙酰胆碱分解，已广泛应用于改善记忆和治疗阿尔茨海默病，引起了世界的广泛关注。该文综述了国内外近40年来有关“蛇足石杉”在系统与分类学、遗传多样性、组学研究、内生真菌、化学成分、资源调查、栽培繁殖和资源保护等方面的研究进展，并从植物分类学研究角度出发，厘清原中国境内分布的蛇足石杉，实应为我国东北地区分布的Huperzia serrata和我国南方分布较广的H. javanica两个物种;该研究结果显示，《植物名实图考》千层塔的基原，应是我国南方广布的石杉属植物H. javanica。考虑到药用植物和药材名称的稳定，将H. javanica的中文名沿用《植物名实图考》中的“千层塔”，H. serrata的中文名处理为“蛇足石杉”。

关键词： 蛇足石杉， 千层塔， 阿尔茨海默病， 基原物种， 自然资源保护

中图分类号：  Q949

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2021）11-1794-16

Original plant and research progress of the

medicinal plant Huperzia javanica

CHEN Sisi1，2， ZHANG Menghua1，2， WANG Jinxiu1， ZHANG Xianchun1*

（ 1. State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany， Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences，

Beijing 100093， China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China ）

Abstract：  The traditional herbal medicine Qiancengta， recorded in the Iconographia Plantarum written in the Qing Dynasty， was previously verified as Lycopodiaceae， Huperzia Bernh，  Huperzia serrata. Huperzine A （HupA）， isolated from Qiancengta during pharmaceutical research， can effectively， highly selectively and reversibly inhibit acetylcholinesterase and reduce the decomposition of acetylcholine. It has been widely used to enhance memory and treat Alzheimer’s disease， attracting worldwide attention. This research reviews the latest research progress of these precious medicinal plants in the past 40 years， including systematics，  genetic diversity， omics research， endophytic fungi， chemical constituents， resource investigation， cultivation and propagation and natural resource conservation. From the perspective of taxonomy， H. serrata in China includes actually two species： H. javanica in South China and H. serrata in Northeast China. The former is the botanical origin recorded in Iconographia Plantarum. Taking into account the stability of the names of medicinal plants and materials， this research propose that the Chinese name of H. javanica follows “Qiancengta” in Iconographia Plantarum and H. serrata follows “Shezushishan”.

Key words： Huperzia serrata， H. javanica， Alzheimer’s disease， original plant， natural resource conservation

千層塔是我国传统名贵中草药，又名蛇足草、金不换等（罗超等，2011），最早以中文名“千层塔”载于清代《植物名实图考》（吴其濬，1848）中，具解毒、除湿、消瘀、止血等功效（杨纯瑜，1982）。20世纪80年代，我国科学家首次从千层塔中提取出石杉碱甲（Huperzine A， HupA）（俞超美等，1982）;1991年，石杉碱甲治疗记忆障碍的作用被发现（Xu et al.， 1995）。目前，石杉碱甲已广泛应用于治疗老年性记忆衰退、认知障碍（胡玉萍和袁德培，2009;Ohba et al.， 2015;Takeshi & Nobutoshi， 2018）和阿尔茨海默病（Orhan et al.， 2011;Desilets et al.， 2009），同时它还具有抗癫痫、麻醉和有机磷解毒等作用（胡玉萍和袁德培，2009;Ohba et al.， 2015;Takeshi & Nobutoshi， 2018），在美国作为一种膳食补充剂上市（Orhan et al.， 2011;Crawford et al.， 2020）。

随着全球人口老龄化的加剧，阿尔茨海默病已成为危害老年人健康的第四大疾病，也是所需医疗费用最高的。我国65岁以上的老年群体中，阿尔茨海默病发病率为5.0%～8.0%，80岁以上发病率可达21.0%（张菁华，2020）。千层塔已是我国治疗阿尔茨海默病的重要药源，但由于千层塔生长周期长，生长缓慢，植株矮小，石杉碱甲含量甚微（仅约0.02%）（孙远明等，2002），现有野生资源远远不能满足药物提取的需求。因此，合理地开发和持续利用这一珍贵的药用植物资源是当今亟待解决的问题。因此，我们整理了自20世纪80年代至今有关蛇足石杉的研究论文进行分析，并以此来探讨该植物必要的保护措施和未来的研究方向。文献来源于中国知网、Web of Science、PubMed、ResearchGate等知名文献检索网站，共检索到与千层塔[多采用了蛇足石杉（Huperzia serrata）这一名称]有关的研究论文共630篇。其中，中文413篇，英文217篇，主要研究内容分布见图1。

1 蛇足石杉和近缘物种的系统与分类

1.1 系统和分类

根据最新的石松类和蕨类分类系统，蛇足石杉属于石松科（Lycopodiaceae）石杉亚科（Huperzioideae）石杉属（Huperzia Bernh）（Group et al.， 2016）。据《中国植物志》（张丽兵，2004）记载，蛇足石杉的学名为Huperzia serrata，其异名有10余个。Shrestha & Zhang（2015）首次对蛇足石杉复合群进行了形态计量学和生态位模拟分析，结果支持蛇足石杉复合群包括4个物种的分类处理，即H. serrata、H. javanica、皱边石杉（H. crispata）和南岭石杉（H. nanlingensis）（图2，图3）。

Huperzia javanica和H. serrata的分类问题长期未能解决。Makino （1898）将H. javanica处理为H. serrata的变种（Lycopodium serratum var. javanicum）。秦仁昌（1981）又将Huperzia javanica处理为H. serrata的长柄变型（H. serrata f. longipetiolata）。杨纯瑜（1982）认为H. serrata f. longipetiolata的叶柄较长，主要分布于中国南方且具有更高的石杉碱甲含量，这些特征明显区别于原变种，因此将其提升为长柄石杉（H. longipetiolata）。隨后，杨纯瑜（1989）认为H. longipetiolata的形态特征和模式与产自爪哇的H. javanica一致，于是将它们进行了归并。Lim et al. （2015）根据叶缘锯齿数量和珠芽苞片形态特征将H. javanica 和H. serrata归类为两个不同物种。

姬生国等（2007）采用叶绿体片段matK探讨10种石杉属植物的系统发育及分子鉴定，结果表明H. serrata与H. longipetiolata分别在不同分支。Ji et al. （2008）基于rbcL和psbA-trnH构建了石松科25个物种的系统发育关系，结果表明皱边石杉和南川石杉（H. nanchuanensis）为姐妹关系，H. serrata和H. serrata var. longipetiolata为姐妹关系，该结果与此前基于matK构建的系统发育结果不一致。Zhang et al. （2017）基于叶绿体基因组数据构建了H. serrata和H. javanica的系统发育关系，结果支持H. serrata和H. javanica为两个不同的物

种（图4），并且与H. javanica相比，H. serrata同北美的亮叶石杉（H. lucidula）的关系更近。

1.2 “千层塔”原植物的学名考证

“千层塔”最早的图文描述记载于清代吴其濬的《植物名实图考》（图5），“千层塔，生山石间。蔓生绿茎，小叶攒生，四面如刺，间有长叶及梢头叶，俱如初生柳叶。可煎洗肿毒、跌打及鼻孔作痒”。《新华本草纲要》最早考证“千层塔”基原为蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.） Trev.]（吴征镒等，1990），并被沿用至今。

吴其濬为河南固始县人，清代河南唯一的状元，一生“宦迹半天下”，其所著《植物名实图考》共记录湖南、湖北、江西、云南、贵州、福建、山西等19个省的植物，其原文虽然未记录“千层塔”产地，但是第十六卷新描述的物种，多为江西植物，故推测“千层塔”产江西。又据绘图，该植物叶片较大，叶片椭圆形或倒阔披针形，中部最宽，叶缘锯齿稀疏，显然不同于东北地区分布的H. serrata，其叶片狭窄，披针形，中部不明显宽阔，叶缘锯齿较密。因此，本研究认为，《植物名实图考》描述记录的“千层塔”，应是我国南方分布的H. javanica，而非北方的H. serrata。

过去文献记载的H. serrata多采用了广义蛇足石杉物种概念，实则包括了H. javanica和H. serrata这2个种，研究材料多来自我国南方省份，在分类上应该是H. javanica。虽然H. javanica的中文名也曾采用过“长柄石杉”（王峻和潘胜利，2005;宋育红等，2010;王小理等，2007），但是考虑到药用植物和药材名称的稳定，宜将南方广布的产石杉碱甲的H. javanica的中文名，沿用清代本草名“千层塔”;北方分布的不产石杉碱甲或含量很低的H. serrata 的中文名使用“蛇足石杉”。地理分布上二者具有明显的地理替代，H. javanica（千层塔）主产我国长江以南地区，以及东南亚热带和亚热带山地，而H. serrata（蛇足石杉）分布于我国华北和东北地区，以及俄罗斯远东地区、朝鲜半岛和日本中北部温带和寒温带山地（图6）。

因此，以往文献中普遍使用的“蛇足石杉” “Huperzia serrata”等植物名称，应按照最新的分类处理，这些产自我国南方省份的“蛇足石杉”其实都是千层塔（H. javanica）植物。

1.3 中国蛇足石杉复合体的分类

中国蛇足石杉复合体的主要鉴别特征、分布和生境描述如下。

1.3.1 皱边石杉 Huperzia crispata （Ching） Ching in Acta Bot. Yunnan. 3（3）： 293.1981. Type： China， Sichuan， Emei Shan， C. H. Hsiung 91099 （paratype， IBSC-590811）.

Lycopodium crispatum Ching in Acta Phytotax. Sin. 18（2）： 236， pl. 1， f. 3. 1980.

茎直立或斜升，株高20～50 cm， 茎粗1.6～4 mm。小枝最宽处2.8～4.3 cm，最窄处1.6～2.5 cm。孢子叶和营养叶同形，叶密集，有光泽，着生在茎上呈直角;叶狭椭圆形，叶最宽的部分在中部，叶长12～20 mm，叶宽1.5～2.5 mm;叶片背面中脉突出明显;叶基楔形，下延，有柄;叶边缘皱曲，呈重锯齿状，强度卷缩，叶尖渐尖。

分布：重庆、广东、广西、贵州、湖北、江西、四川和云南。

生境：生于林下潮湿处，海拔900～2 600 m。

1.3.2 蛇足石杉 Huperzia serrata （Thunb.） Trev. in Atti Soc. Ital. Sci. Nat. 17（2）： 248. 1874. Type： Japan， Thunberg s.n. （holotype， UPS-25333B）.

Lycopodium serratum Thunb. in Syst. Veg. ed. 14： 944. 1784.

茎直立或斜向上生，株高15～25 cm，茎径1.5～2 mm。顶芽分叉宽处1.5～2 cm，窄处0.5～1 cm。孢子叶和营养叶同形，营养叶密集着生，在茎上呈直角或稍下弯曲;叶披针形，叶片长5～15 mm，近中部最宽处1～2.5 mm;叶片背面中脉不明显;叶基楔形，下延，有柄;叶边缘不皱曲，锯齿状，叶尖渐尖。

分布：黑龙江、吉林和辽宁。

生境：生于林下，路边干燥的地方;海拔400～1 000 m。

1.3.3 南岭石杉 Huperzia nanlingensis Y. H. Yan et N. Shrestha in Phytotaxa 173 （1）：73-79. 2014. Type： China， Guangdong， Ruyuan， Y. H. Yan et al. 1051 （holotype， IBSC; isotype， HUST-870）.

株高20～35 cm，茎粗约3 mm，基部横卧，上部呈紫色。小枝最宽处4.5～5.5 cm，窄处0.7～0.9 cm。孢子叶和营养叶同形，营养叶着生在茎上呈直角或稍向上斜展，叶片椭圆状披针形，长20～30 cm，宽3～5 mm，革质，光滑，叶片紫红色;叶片背面中脉不明显;叶基楔形，具柄;叶边缘不皱曲，锯齿状，叶尖急尖。孢子叶长2～4 mm，宽0.5 mm，在茎上反折，革质，绿色，边缘略有锯齿，叶尖急尖，叶基楔形，无柄。

分布：贵州、湖南和广东。

生境：生于林下腐殖质丰富的砂土上和阴湿的地面上，海拔1 100～1 400 m。

1.3.4 千层塔  Huperzia javanica（Sw.） C.Y. Yang in Bulletin of the Academy of Milit Med Sci 13（5）： 368. 1989. Type： Indonesia. Java， Thunberg s.n. （holotype， UPS-25320B）

Lycopodium javanicum Sw. in Journal für die Botanik 1800（2）： 114. 1801. Lycopodium serratum var. longipetiolatum Spring in Monogr.Lycop. 2： 18， pl. 1， f. 9-11. 1850. Huperzia serrata var. javanicum Makino in Bot. Mag. 12： 13. 1898. Huperzia serrata f. longipetiolata （Spring） Ching in Acta Bot.Yunnan 3（3）： 294. 1981. Huperzia longipetiolata （Spring） C.Y. Yang in Chin Tradit Herb Drugs 16（7）： 32-33. 1982.

茎直立或斜向上，株高10～30 cm，茎粗1.5～3.5 mm。分枝最宽处2～5 cm，最窄处1～2.5 cm。孢子叶和营养叶同形，营养叶稀疏，在茎上呈直角着生;叶椭圆形或倒阔披针形，中部或中上部最宽，长10～25 mm，宽2～6 mm;叶片背面中脉不明显;叶片基部明显狭缩下延，叶基楔形，有柄;叶边缘不皱曲，具不规则锯齿状，叶尖急尖。孢子叶稀疏，在茎上呈直角着生或稍下弯曲，叶片椭圆形或披针形，长7～15 mm，宽1.5～3.5 mm，中脉不明显，叶尖急尖，叶基楔形，下延，有柄，柄长1～3.5 mm，边缘具不规则锯齿。

分布：安徽、重庆、福建、廣东、广西、贵州、海南、湖北、湖南、江苏、江西、四川、台湾、西藏、云南和浙江。

生境：生于林下地上和路边;海拔300～1 200 m。

2 遗传多样性

遗传多样性是生物多样性的核心，体现了生物的稳定性和进化潜力。研究千层塔的遗传多样性有助于评估其进化地位，为保护和开发千层塔资源奠定基础。

最初，Luo et al. （2010）对千层塔的根、茎和叶进行454-EST测序，共获得2 729个SSR位点，但并未进行深入探讨。张林甦等（2018）对采自贵州的千层塔的根、茎、叶、芽与孢子进行转录组测序，共获得50 388个SNP位点和11 934条SSR序列，随后设计并获得了12 010对SSR引物，筛选出的SSR长度在150 bp左右，代表中等程度的多态性。何美娜（2017）对中国五个地区的千层塔进行了转录组测序，SSR分析结果表明千层塔群体间遗传相似性很高，居群内比群体间的遗传变异高，不同群体间基因流水平也较高，高水平的基因流有利于增加遗传多样性，降低居群间分化程度。与之类似，扩增片段长度多态性（AFLP）分子标记（黄骥等，2014）、简单重复序列区间扩增（ISSR）和目标起始密码子多态性（SCoT）分子标记（Minh et al.， 2019）结果均表明千层塔野生资源的遗传多样性丰富，具有较高的基因流和较强的环境适应能力，因此造成目前野生千层塔资源稀少的主要原因不是其遗传多样性的丧失，而更可能是人类活动造成的生境破坏和对千层塔的过度采挖。

3 组学研究进展

近几十年来，组学技术飞速发展，主要包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学、糖组学等，对千层塔和蛇足石杉进行的各类组学研究有助于深入了解石杉碱甲的合成代谢途径，是寻找替代石杉碱甲源植物生产药物的新途径。表1汇总了近年来以千层塔和蛇足石杉为研究对象的组学研究，研究对象以千层塔居多，研究方法以转录组学居多。

3.1 质体基因组学

Guo et al. （2016）首次报道了蛇足石杉（H. serrata）的质体基因组大小为154 176 bp，GC含量为36.3%，包含了86个编码基因，30个tRNA基因和4个rRNA基因（图7）。Zhang et al. （2017）报道了千层塔（H. javanica）的质体基因组结构，结果表明千层塔的质体基因组大小为154 415 bp，GC含量为36.4%，包含了86个编码基因，29个tRNA基因和4个rRNA基因，千层塔和蛇足石杉的质体基因组在大小、GC含量和tRNA基因数量上略存在差异。Zhang et al. （2017）利用质体基因组建立的系统发育关系（图4）也表明，千层塔和蛇足石杉在质体基因组上已经发生明显分化。

3.2 转录组学

千层塔和蛇足石杉转录组学研究始于2010年。Luo et al. （2010）通过对千层塔和同样富有药用价值的龙骨马尾杉（Phlegmariurus carinatus）进行比较转录组研究，共注释出千层塔16 274个转录本和许多可能参与三萜类、生物碱和黄酮/类黄酮合成和生长发育相关的基因。Luo et al. （2010）测序并注释出96个可能在石杉碱甲合成中参与环化、重排、修饰和氧化的CYP450基因家族，他们选择其中20个进行了实时PCR分析，结果显示CYP450在叶中的表达水平比在根中更高。

何美娜（2017）和Guo et al. （2019）利用Illumina Highseq平台对千层塔地上部分构建了cDNA库，获得的111 251个转录本中有48 989条比对数据库并成功注释，注释结果也显示千层塔中表达有许多与生物碱合成代谢相关的基因，他们还通过KEGG分析发现了与石杉碱甲合成相关的通路（赖氨酸合成途径）和代谢相关的通路（赖氨酸降解途径）。Yang et al. （2017） 对千层塔的根、茎、叶、孢子分别进行转录组测序，共注释出105 516个转录本，是目前为止注释出转录本数量最多的研究，其转录组学分析表明千层塔中至少存在21个功能通路，并预测出参与石杉碱甲前体生物合成的LDC、CAO和PKS三种候选酶基因，还预测出1 478个SSR和2 975个转录因子基因;之后采用qRT-PCR成功验证了HsLDC、HsCAO、HsPKS和CYP450s等7个参与石杉碱甲生物合成的基因。

Peng et al. （2020）对千层塔的嫩叶、老叶和茎分别进行转录组测序，共注释出49 923个转录本，该研究对不同组织之间和相同组织不同重复间进行了差异表达分析，结果显示40 612个转录本在所有组织中普遍表达，9 311个转录本在一个或两个组织中独特表达。该研究重点关注了在石杉碱甲合成早期阶段起作用的两个LDC和3个CAO基因，LDC1在老叶中最高，幼叶和茎次之，而LDC2在三种组织中表达量相似;CAO1序列在三种组织中都有发现，且叶片高于茎，而CAO2序列为嫩叶仅有;CAO3序列只来自于叶片，老叶的表达量高于嫩叶。

转录组测序技术正不断成熟，加上价格适宜，已成为众多生物学家研究千层塔等中药材的不二之选。伴随着转录组测序技术的进步，识别出的转录本不断积累和增加，参与石杉碱甲代谢途径各个阶段的基因也逐将分解清晰。结合表1统计的研究对象分布的地理位置和中国蛇足石杉复合体分布图（图6）可知，可能是由于千层塔的分布地域辽阔，更容易采获，尽管论文中都使用了蛇足石杉和H. serrata这一学名，但是转录组学的实际研究对象均为千层塔，人们对蛇足石杉（H. serrata）的转录组研究还不了解。

3.3 蛋白质组学

林如辉（2009）对来自三个不同产地的千层塔的蛋白质组学进行研究，共得到15个差异蛋白质点。余晓等（2019）对产石杉碱甲能力不同的三个千层塔株系进行串联质谱标签（TMT）定量蛋白质组学研究，结果显示含量最低与含量最高的株系之间具有78个差异蛋白，其中参与生物碱代谢途径的差异蛋白有Q8RXU4和P93541兩种，前者在低含量的株系中表达下调，后者在高含量的株系中表达下调。

这些研究为HupA的生物合成途径和深入探讨其中的关键酶系提供了依据，也体现了不同产地生长的千层塔具有遗传的多样性。因此，在开展千层塔的引种、栽培、繁殖等工作时，应注意到遗传背景生态因子等差异对产量带来的影响。

3.4 代谢组学

由于石杉碱甲的特殊功效，代谢组学最初的研究重点在石杉碱甲，因此多为靶向代谢组学（Ma et al.， 2005; Cuthbertson et al.， 2012）。随着技术的发展与研究范围的扩大，Ishiuchi et al. （2013）基于超高效液相色谱法与质谱联用（UPLC-MS）的代谢组学方法鉴定出27种石松生物碱。Wu et al. （2018）利用一种UPLC-MS相对定量的代谢组学方法，对千层塔叶、茎、根不同组织进行了综合代谢组学分析，借助一种新型计算工具最终鉴定出118种可能的化学物质，还发现了两种区分不同组织的代谢标志物Peak4388和Peak3954。

许多石松生物碱具有相同的分子式和分子骨架，相似的质谱和色谱谱图，这成为鉴定石松生物碱和研究石杉代谢组学的一大障碍。未来有望研发出更精准的识别工具和鉴定方法，实现石松生物碱的精准鉴定。

4 内生真菌

内生真菌是指存在于宿主植物生活史的某个或整个阶段的组织内或者细胞间隙中，而不会导致宿主出现明显病害症状的真菌（Wilson，1995）。内生真菌可产生多种对宿主有益并具有药理活性的次生代谢产物（郭龙妹等，2019），有些内生真菌还能产生与宿主相似或者相同的代谢产物（任静，2020）。自1993年从短叶红豆杉（Taxus breviflia）分离出一株能够和宿主一样产紫杉醇的内生真菌（Taxomyces andreanae）以来，利用内生真菌发酵培养进行天然化合物的生物合成逐渐成为研究热点（Stierle et al.， 1993）。

野生千层塔和蛇足石杉含有大量的内生真菌，其中，茎和叶中内生真菌数量远多于根内（张琳等，2010;汪涯等，2011）。近年来，这些内生真菌产石杉碱甲的潜力已被研究者发现和重视，有关千层塔内生真菌及其代谢产物的研究也逐年增多。张鑫（2018）总结往年文献，汇总出经ITS序列和《真菌鉴定手册》鉴定的内生真菌249株，其中产石杉碱甲的真菌有32株，19株已检测出石杉碱甲产率。

千层塔和蛇足石杉近缘种属植物内生真菌的研究也取得了一些进展。针对皱边石杉内生真菌的一些研究发现，其中一些内生真菌也具有生产石杉碱甲的潜力（禹利君，2007;史云峰，2012;胥锦桦，2012）。小杉兰的配子体和孢子体中同样存在许多内生真菌，其物种多样性和物种丰富度与环境有关，尤其是和海拔呈正相关（Budziszewska & SzypuA， 2010）。

尽管更多能够生产石杉碱甲的千层塔和蛇足石杉内生真菌正不断被鉴定分离出来，但是由于菌种退化和产量甚微等问题，距离满足临床需求和实现工业化生产还存在很大距离（Zhang et al.， 2011）。利用生物合成生产石杉碱甲的方法新型、高效又环保（Chen et al.， 2014），具有重要的开发价值和潜力。随着相关研究的不断深入，相信实现石杉碱甲的工厂化生产为期不远。

5 化学成分

各种分离方法已应用于分离检测千层塔的化学成分，如薄层反复硅胶柱层析、RP-18反相硅胶、薄层硅胶层析板、Sephadex LH-20凝胶柱等，分离出的主要成分有生物碱、黄酮类、三萜类、多糖、有机酸、蒽醌等（李关艳，2017）。截至2017年，从千层塔及其亲缘物种中分离出的生物碱已有300多种（王义坤等，2017），但除了石杉碱甲，其他生物碱鲜有乙酰胆碱酯酶抑制能力，有抑制能力的生物碱的生物活性也大都低于石杉碱甲（谭昌恒和朱大元，2003）。

石杉碱甲作为千层塔的重要化学成分，已有研究报道了它可能的生物合成途径（谢峻等，2020）。但是具体的生物合成途径，特别是下游的具体步骤仍不清楚，想要通过人工合成获得石杉碱甲仍存在挑战。因此，寻找更优的石杉碱甲源植物也备受关注。

已有大量研究报道了石杉碱甲在千层塔及其近缘类群的不同部位、不同成长阶段、不同居群中的含量差异性（邵浩等，2009;杜次等，2013;温慧敏等，2014）。目前，对我国湖南和浙江的千层塔个体或居群进行的石杉碱甲含量测定最多，其次为贵州、湖北和福建等地，而西南地区最少（图6）。植株不同部位的石杉碱甲含量通常是根<叶≈茎，叶和茎的石杉碱甲含量最高为根的10倍（孙远明等，2002;顾月华和吴庆庆，2005;郭水良等，2006;邵浩等，2009;王峻和潘胜利，2009;郑雅媗等，2013;杜次等，2013;张方方等，2015）。除石杉属植物能产石杉碱甲（Ma & Gang， 2008;王峻和潘胜利等，2009）外，石松科其他植物，如石杉属的伏帖石杉（H. adpressa）（王峻和潘胜利，2009）、马尾杉属的喜马拉雅马尾杉（Plegmariurus hamiltonii）（郭水良等，2006）和柳杉叶马尾杉（P. cryptomerinus）等也含石杉碱甲（王峻等，2003;王峻和潘胜利， 2009;赵惠等，2018），含量為0.15%～0.20%。

6 繁殖技术

野生石杉属植物植株生长十分缓慢（齐耀东和王德立，2017），且千层塔和蛇足石杉的生长发育和微乎其微的石杉碱甲含量还易受环境因素的影响（王志安等，2008;石玮等，2008）。为了在满足药物生产需求的同时保护石杉资源，建立合适的人工繁殖体系刻不容缓。

6.1 扦插繁殖

扦插繁殖受到植物本身的生物学特性、插条的发育程度和长度、生长调节剂和环境等因素的影响。现已证明能促进千层塔扦插成活的激素有吲哚丁酸（IBA）（盛束军等，2000）和芸苔素内酯（BR）（冯世鑫等，2010），而萘乙酸（NAA）（盛束军等，2000）和赤霉素（GA）（曾汉元和张伍佰，2008）效果甚微，甚至会出现抑制现象。茎尖似乎是插条不可或缺的部位，不带茎尖的扦插植株无一存活（龙华等，2014）。在培养基质方面，混合土壤比单一土壤更适合千层塔扦插（盛束军等，2000;冯世鑫等，2010）。土壤中的微生物、内生真菌和外共生真菌也影响着扦插的效果（李娜等，2007，2008;骆冰洁，2016）。

6.2 珠芽繁殖

珠芽繁殖虽然在数量上不及孢子繁殖，但是珠芽繁殖的萌发和生长速度快，培育简单。珠芽繁殖出的一年生苗高约为2.2 cm，两年生苗高约6.0 cm（曾汉元和张伍佰，2008）。珠芽喜弱光，萌发的最适宜温度是（22±2） ℃。外源激素似乎并不促进珠芽萌发，GA3、NAA和IAA对珠芽萌发都具有一定的抑制作用（骆冰洁，2016）。

6.3 组织培养

组织培养过程中可能存在的微生物和千层塔本身茎段皮层中共生的内生真菌使得外植体的消毒成为千层塔组织培养的首要难题（刘建成等，2019）。研究表明，先对野生植株进行室内水培或土培，再取茎尖进行组培能大大降低染菌率，成活率在70%以上（沈晓霞等，2002）。采用侧芽、茎尖、幼根与孢子等均能诱导愈伤组织，但千层塔愈伤组织诱导率并不高（周颖等，2009;包日双等，2012）。还可采用浅层液体培养千层塔叶状体，效果比传统固体培养更好（袁慧慧等，2019）。

6.4 引种栽培和人工驯化

引种栽培和人工驯化也是生产植物中药材常用的方法。选择合适的土壤，且在较高荫蔽度和湿度的环境下能提升人工栽培成活率（林如辉，2009）。不同基质对移栽也有影响，水苔的移栽成活率最高，腐殖质土壤次之（包日双，2013），碱性土壤不适合千层塔迁移苗，应注意选用弱酸性土壤（曾汉元和张伍佰，2008）。在新品种选育上，闫志刚等（2012，2014）通过3 a的淘汰选择，成功育成高产新品种“容杉1号”“容杉2号”。

由于千层塔和蛇足石杉本身生长缓慢，繁殖能力弱，生长需要一定海拔和荫湿环境，很难进行人工快速繁育，大量的人工繁殖和栽培目前还没有成功，因此药材收购仍然依赖于野生植物资源。尽管已有不少高产新品种培育出来，但是中高产品种的应用与培育同样重要。如何缩小培育成本，实现资源药用植物的批量生产是一大难题，仍需投入更多努力。

7 资源现状

吴荭等（2005）结合野外采样与当时的标本和文献资料对全国千层塔和蛇足石杉资源进行调查和评估，结果发现分布面积为260×104  km2，天然产物量为4 656.6 t，结合实际后的理论采样量为1 604 t;该研究还指出，尽管千层塔和蛇足石杉分布很广，但是它植株矮小，呈零星散生状分布，多生长在自然保护区内和风景区，且更新周期长，不支持大规模开采。马小军等（2009）对广西千层塔主要分布区的调查结果也支持这一点。此外，一些千层塔种群正在衰退，在自然保护的情况下种群的生存状况仍然严峻（潘丽梅等，2015）。黄骥等（2011）对武陵山区千层塔居群进行了较全面的研究，表明千层塔在草本层较单一，且种间竞争较弱的生境中，常能形成小片优势，而在物种组成繁杂、种间竞争较大的群落中，仅零星分布，这种对特定生态位的选择，使其在分布上呈现居群间相互隔离，居群内因生境异质化而造成片断化分布的特点。齐耀东和王德立（2017）调查江西、贵州、广西、重庆及海南的千层塔天然种群发现这些调查样地的居群结构相似，幼苗和幼株为居群的主要构成，成株相对较少。这些地区的资源破坏严重，特别是贵州样地有可能出现物种濒危情况，实地资源调查显示重庆和四川的一些地区的千层塔即将或已经灭绝，可能是原始林减少、生境干旱、农事影响、人为采集等造成的（王德立等，2011）。

总的来说，由于千层塔生长缓慢、分布零散，本就不适合大规模开采，全球温度变化、城市化等也正对千层塔带来不利影响，但作为近几十年来引起人们广泛关注的阿尔茨海默病药用植物，野生千层塔资源正遭受着大量人为采集，生境被肆意破坏。为了保护药用资源可持续发展，保护生物多样性，亟待加强对千层塔野生资源的保护。

8 展望

千层塔自古以来就是一味珍稀的中草药，具有退热、止血、消肿散毒等功效。随着千层塔的有效成分石杉碱甲治疗阿尔茨海默病的功效广为人知，近40年来千层塔野生植物资源被人们大量采挖，造成极度的资源短缺。本文考证地理、形态、名实出处等各个方面，澄清了一直以来人们认为蛇足石杉（H. serrata）就是千层塔的误解，指出药用千层塔实际是指产自我国南部的H. javanica，模式标本采自印度爪哇。本文从系统与分类学、遗传多样性、组学研究、内生真菌、化学成分、资源调查、栽培繁殖和资源保护等各个方面综述了近年来有关千层塔的研究，总结和思考未来千层塔的研究方向，我们坚信对千层塔的研究势必能为治疗阿尔茨海默病带来突破性进展。

伴随着世界人口老龄化的趋势，越来越多老年人罹患阿尔茨海默病。据WHO统计，截至2015年全球阿尔茨海默病患者约有2 980万人，预计2030年将增长到6 600万人，2050年预计高达1.15亿（Reitz & Mayeux， 2014; Mancuso & Santangelo，2018）。与此同时，青少年对益智产品的需求也不断增长。在众多阿尔茨海默病治疗药物以及益智产品中，石杉碱甲以其作用时效长、副作用少而获得大众青睐。在自然界中，石杉属植物生长需要一定的海拔、光照和荫湿环境，自然界中很难依靠孢子快速繁殖，也很难通过组织培养批量生产。石杉碱甲的化学合成虽已实现，但成本还是太高，难以满足市场实际需求;现在市面上生产石杉碱甲还是依靠大规模采集野生资源，这导致石杉属植物原始生境被破坏，种群数量急剧下降。不只是千层塔，含石杉碱甲的其他石杉属和马尾杉属植物资源都已被过度开采，亟待对这两个属的植物开展人工栽培和繁殖研究，建议将马尾杉属和石杉属的全部物种列入国家重点保护植物名录，以加强对野生药物资源的有效保护和可持续性利用。

为了走出这一困境，科学工作者已從多个方面做出努力，并取得了一定成果。首先是建立快速繁殖体系扩大生产，主要包括孢子繁衍、扦插繁殖、分株繁殖、芽孢繁殖和组织培养等方法。但是千层塔的有性繁殖非常困难，孢子发育周期漫长，孢子繁育难度很大，仍需深入开展基础理论研究来探索孢子的最佳破壁方式和最佳萌发条件;而扦插繁殖和分株繁殖的繁殖系数低;珠芽繁殖虽然萌发率和成活率高，但是珠芽的数量稀少，生成条件苛刻，也是接下来需要攻克的壁垒;组织培养则依赖无菌环境，耗时耗力，目前诱导率也不高，这些研究都没有实现千层塔的大批量生产。目前，石杉碱甲的化学合成成本仍然太高，而内生真菌生产石杉碱甲的周期短、成本低、易培养，具有极大的研究潜力和应用前景，今后可从内生真菌发酵培养及合成生物学方面开展深入的研究，提出石杉碱甲生物合成的创新方法。还可通过基因组学、蛋白质组学、转录组学等组学方法和分子生物学对石杉碱甲合成通路进行完整剖析，运用生物技术验证基因的表达和酶的作用原理，或结合组培技术和内生真菌发酵技术生产石杉碱甲，或从分子水平对千层塔进行品质改良。不管是哪种繁殖方法，都需要强大的种质基础，但目前对于蛇足石杉复合体的物种分类和划分还不统一，有必要进一步在全国范围内广泛开展石杉属资源调研，寻找最具潜力的种质资源。

千层塔的深入研究、开发利用和资源保护之路任重道远。千层塔的研究突破是广大阿尔茨海默病患者的福音，也是老龄化逐渐加剧的社会的福音。

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（责任编辑 何永艳）