和胃反流康对胆汁反流性胃炎大鼠胃黏膜p38MAPK蛋白及COX-2mRNA表达的影响

汪楠，李岩

（辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032）

胆汁反流性胃炎（bile reflux gastritis，BRG），是多种原因引起胃黏膜组织损伤的一种疾病，由于十二指肠胃反流（duodeno gastric reflux，DGR）现象异常增多导致[1]，属消化内科常见疾病之一，其发生与幽门功能下降、胃窦清除能力降低、十二指肠动力异常等因素有关[2]。这些因素的存在既可增加十二指肠—胃反流，又可导致胃排空延缓，延长胃黏膜与反流液的接触时间，从而加重胃黏膜的损伤。目前，西医对胆汁反流性胃炎的治疗主要应用促胃动力药、胃黏膜保护剂及抑酸剂等，多有不同程度的副作用存在，增加了耐药性及药物副作用的可能性，故不宜长期服用。大量临床实践表明，中药具有疗效高、靶点多、副作用小等优势，更有益于该病的治疗。

和胃反流康是我院消化科多年临床观察筛选的效方，广泛应用于各类消化性疾病患者的治疗，如慢性非萎缩性胃炎、胆汁反流性胃炎、非溃疡性消化不良等常见疾病。本方具有疏肝利胆、益气健脾、和胃降逆之功效，大量临床实践证明，和胃反流康具有良好的疗效，可以明显缓解患者胃痛、胃胀、反酸、烧心、嘈杂等症状。p38MAPK是MAPKs家族中控制炎症反应最重要的家族成员之一，它可以促进白细胞的聚集和活化，参与转录因子的活性调节及细胞因子的合成，对炎症反应的调控起着至关重要的作用。COX-2是使花生四烯酸产生前列腺素的关键酶，当细胞受到各种刺激因素作用时，如细胞因子、生长因子、炎性介质等，COX-2的表达迅速上升，尤其在炎症区域表达显著上调。因此，通过观察和胃反流康对大鼠胃黏膜p38MAPK蛋白及胃黏膜细胞COX-2mRNA表达的影响，有助于了解其对胃黏膜炎性损害的改善，具有防止胃黏膜肠上皮化生及不典型增生等癌前病变发生的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康的Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量（200±20）g，于辽宁长生生物技术有限公司购买[SCXK（辽）2010-0001]。购入后于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物室内饲养[SYXK（辽）2013-0009]，给予常规颗粒饲料，室温（20±2） ℃，相对湿度45%，12 h昼夜节律，自由食水。

1.1.2 实验药品及制备 1）和胃反流康方剂，组成有柴胡15 g，陈皮10 g，白芍10 g，枳壳10 g，香附15 g，炒白术15 g，茯苓10 g，黄连6 g，蒲公英20 g，半夏10 g，甘草10 g。以上中草药均于辽宁中医药大学附属医院中药局购买，水煎浓缩，分别制成含量为1.37 g·mL-1、2.73 g·mL-1和5.46 g·mL-1的混悬液；2）吗丁啉（规格10 mg），西安杨森制药有限公司生产（批号：090820214），使用前水煎浓缩，制成含量为2.78 mg·mL-1的混悬液；3）牛磺胆酸钠（T6510），北京博奥拓达生物科技有限公司生产；4）胰酶（0458），Amresco公司生产；5）卵磷脂（P5638），sigma公司生产。

1.1.3 主要试剂 1）Anti-p38MAPK，abcam公司生产；2）HRP标记的羊抗兔二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司生产；3）蛋白提取试剂盒、蛋白marker，杭州碧云天生物技术研究所生产；4）ECL发光试剂盒，Therom公司生产；5）RT-PCR试剂盒，大连宝生物公司生产；6）DNA marker，北京全式金生物技术有限公司生产；7）Trizol，Invitrogen生产；8）引物，由北京三博远志生物技术有限公司代为合成。

1.1.4 主要仪器及设备 1）EPS-300型电泳仪、DYCP-40E型电泳槽、4200SF型凝胶成像分析系统，上海天能科技有限公司生产；2）MyCycler ThermalCycl型梯度PCR仪（BIO-RAD），美国伯乐公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 反流液配制 依据相关文献[3]，将牛磺胆酸钠2.5 g，胰酶1.5 g，卵磷脂0.25 g溶于蒸馏水100 mL中配制成反流液。

1.2.2 分组、造模及给药 将60只大鼠随机分为6组，即空白组、模型组、和胃反流康高、中、低剂量组、吗叮啉组，每组 10只。除空白组外，其余各组大鼠用配制好的灌流液灌胃造模，给药体积为15 mL·kg-1，每日1次，连续35 d。空白组和模型组给予等容量的蒸馏水灌胃，和胃反流康高、中、低剂量组分别以54.6 g·kg-1、27.3 g·kg-1、13.7 g·kg-1生药灌胃，吗叮啉组以2.78 mg·kg-1灌胃，各给药组自造模开始后第2周至第5周造模结束连续给药，每天于造模结束6 h后灌胃给药，每日1次[4]。

1.3 取材及指标检测

1.3.1 胃窦部胃黏膜组织p38MAPK蛋白表达水平各组大鼠末次给药前1 d，禁食不禁水24 h，末次给药后，无菌操作剖腹取胃，将胃内容物用冰生理盐水漂洗干净，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存备用。采用western-blot法检测各组大鼠胃窦部胃黏膜组织中p38MAPK蛋白表达水平。凝胶成像分析系统采集图像，测定条带灰度值，并以目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值作为该例样本蛋白表达相对水平。

1.3.2 胃窦部胃黏膜组织COX-2mRNA表达水平各组大鼠末次给药前1 d，禁食不禁水24 h，末次给药后，无菌操作剖腹取胃，将胃内容物用冰生理盐水漂洗干净，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存备用。采用RT-PCR法检测各组大鼠胃窦部胃粘膜组织中COX-2 mRNA表达水平，取254 nm波长的紫外灯，仔细观察，在凝胶成像系统中拍照，并予以保存。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析进行，以P＜0.01，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p38MAPK蛋白表达水平

模型组较之于空白组，大鼠胃黏膜组织p38MAPK表达水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；较之于模型组，和胃反流康高、中、低剂量组及吗丁啉组大鼠胃黏膜组织中p38MAPK蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01）；较之于吗丁啉组，和胃反流康高剂量组大鼠胃黏膜组织中p38MAPK蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），而和胃反流康中、低剂量组与之比较则差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。

表1 各组胃窦部胃黏膜组织中p38MAPK蛋白表达水平（±s，n = 6）

表1 各组胃窦部胃黏膜组织中p38MAPK蛋白表达水平（±s，n = 6）

注：与空白组比较，# P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与吗丁啉组比较，▲P＜0.05

组别p38MAPK空白组0.228±0.062模型组0.739±0.063#和胃反流康高剂量组0.429±0.068 #△▲和胃反流康中剂量组0.479±0.065 #△和胃反流康低剂量组0.569±0.075 #△吗丁啉组 0.529±0.058 #△

图1 各组胃黏膜组织p38MAPK蛋白表达比较

2.2 COX-2mRNA表达水平

模型组较之于空白组，大鼠胃黏膜组织COX-2mRNA表达水平明显升高，有统计学差异（P＜0.01）；较之于模型组，和胃反流康高、中、低剂量组及吗丁啉组大鼠胃黏膜组织中COX-2mRNA表达水平均明显降低（P＜0.01）；较之于吗丁啉组，和胃反流康高剂量组大鼠COX-2mRNA表达水平明显降低（P＜0.01），低剂量组与之比较表达水平明显升高（P＜0.05），而中剂量组与之比较则无明显差异（P＞0.05）。见表2、图2。

表2 各组胃窦部胃黏膜组织中COX-2mRNA表达水平（±s，n = 6）

表2 各组胃窦部胃黏膜组织中COX-2mRNA表达水平（±s，n = 6）

注：与空白组比较，# P＜0.01；与模型组比较，△ P＜0.01；与吗丁啉组比较，▲ P＜0.05，▲▲ P＜0.01

组别COX-2mRNA空白组0.258±0.046模型组 0.618±0.061 #和胃反流康高剂量组 0.310±0.030#□▲▲和胃反流康中剂量组 0.435±0.068 #□和胃反流康低剂量组 0.485±0.063# □▲吗丁啉组 0.415±0.043 #□

图2 各组胃黏膜组织COX-2mRNA表达水平比较

3 讨论

在胆汁反流性胃炎形成过程中，胆汁酸是造成黏膜损伤的最主要因素，胰酶和溶血卵磷脂次之。胆汁酸是胆汁的主要成分，属亲脂性类固醇，其“皂化”特性极强，胃黏膜屏障也因此受损[5]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是一类广泛存在于哺乳动物细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其参与的信号传导通路在大多数细胞中普遍存在，可将细胞外刺激信号传导至细胞及其细胞核内，从而引起多种细胞生物学反应，如细胞增殖、分化、细胞周期及凋亡等，并与炎症及其他多种疾病的发生发展密切相关[6]。研究表明，p38MAPK是MAPKs家族中控制炎症反应最重要的家族成员之一，它可以促进白细胞的聚集和活化，对转录因子的活性及细胞因子的合成均有调节作用，对炎症反应的调控起着至关重要的作用[7-9]。抑制p38MAPK参与的信号通路传导可有效的调控肿瘤细胞凋亡，降低HP诱导的胃癌细胞COX-2表达等[10-13]。COX-2是一种诱导酶，是使花生四烯酸产生前列腺素的关键酶，正常组织中无COX-2表达，当细胞受到各种刺激因素作用时，如细胞因子、生长因子、炎性介质等，COX-2的表达迅速上升，尤其在炎症区域表达显著上调，其产物前列腺素（prostaglandins，PGs）可进入核内，调节靶细胞基因的转录[14]。近年研究表明，COX-2在多种肿瘤组织中表达增强，与肿瘤的发生、发展及转移密切相关[15-16]。如胃癌发生发展过程中，COX-2表达升高是的一个重要因子，在萎缩性胃炎伴有肠上皮化生、不典型增生及早期胃癌的情况下，表达更是显著增高[11-12]。本实验通过观察和胃反流康对大鼠胃黏膜p38MAPK蛋白及COX-2mRNA表达的影响，有助于了解其对胃黏膜炎性损害的改善，防止胃黏膜肠上皮化生及不典型增生等癌前病变发生的作用。