α-生育酚通过抑制mTOR激活小鼠海马神经元细胞自噬

武霁舟，王省

（南京中医药大学基础医学院/转化系统生物学与神经科学研究中心/中医脑病学重点实验室，南京 210023）

自噬广泛存在于真核生物，与各种生理活动和病理变化密切相关[1]。自噬作为促生存机制[2-3]，当细胞内环境稳态改变或机体受到刺激时，能够清除胞内损伤的细胞器，保护细胞免于凋亡和坏死，在维持能量代谢、内环境稳态等方面起着重要作用[4]。细胞自噬还可以引起II型程序性细胞死亡，以清除受损细胞[5]，但过度激活可能导致多种疾病的发生[6]。

α-生育酚是维生素E的一种存在形式，具有很强的抗氧化能力[7-9]。越来越多的研究发现，抗氧化能力和自噬具有一定联系[10-12]。因此，本研究在此基础上，以HT22小鼠海马神经元细胞为研究对象，观察自噬现象，探索α-生育酚对细胞自噬的影响以及可能的分子机制。

1 材料与设备

1.1 细胞

HT22海马细胞由南京中医药大学药学院馈赠。

1.2 药物和试剂

1）α-生育酚（上海元叶生物科技有限公司，批号J01020RA14，BR，纯度50%）；2）抗体LC3-II，p-AMPK，p-mTOR（Cell Signaling Technology公司，批号分别为12753s，2535s，2971s）；3）p62（Sigma公司，货号P0067）；4）RAPA裂解液（碧云天，P0013K）；5）BSA（Biofroxx公司，货号4240GR100）；6）PBS（HyClone，货号SH30256.01）；7）Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，Gibco公司，货号C11995500BT）；8）MTT（BioFroxx公司，货号3580GR001）；9）0.25%Trypsin-EDTA（Gibco，货号25200-056）。

1.3 仪器

1）垂直电泳槽（Bio-RAD，货号041BR11339）；2）超微量生物检测仪（NanoDrop 2000，货号G402）；3）自动化学发光图像分析系统（Tanon-5200，货号13T12NPFLI-1157）；4）高速离心机（Thermo Fisher，货号75002455）。

2 方法

2.1 HT22细胞的培养及实验分组

HT22细胞接种于10%FBS-DMEM完全培养基，于恒温培养箱（37℃，5%CO2，95%空气，饱和湿度）进行培养，1～2 d全量换液，待细胞融合度达70%～80%进行传代。取对数生长期的HT22细胞，接种于6孔/96孔微量培养板，在完全培养基处理24 h后，随机分为4组：1）Control组：1%FBS-DMEM处理24 h；2）C.C组：15 μm compound C处理24 h；3）α-生育酚组：25 μm α-生育酚处理 24 h；4）C.C＋ α-生育酚组：15 μm compound C 和 25 μm α-生育酚共同处理24 h。

2.2 免疫荧光法（AO）检测自噬溶酶体

将HT22细胞接种于6孔板，按照设定的分组处理后，细胞在由PBS配制的1 ug·mL-1AO溶液中室温孵育10 min，使用PBS洗涤细胞3次，在荧光显微镜下观察样品。

2.3 透射电镜（TEM）检测自噬体

细胞按设定的分组处理后，收集细胞置于2.5%戊二醛溶液固定、PBS洗涤、1%四氧化锇溶液固定、PBS洗涤、梯度乙醇脱水、非环氧树脂单体包埋。超薄切片60～80 nm后，用3%醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电子显微镜观察自噬体。

2.4 Western blot法检测蛋白表达

将细胞接种于6孔板，按照设定的分组处理后，消化并收集细胞，经PBS洗涤后于冰上使用裂解液提取细胞总蛋白，测定并调整蛋白浓度，加热变性后于-20℃冰箱保存。每组取等量蛋白进行电泳分离，将蛋白转移至PDVF膜上后，于1%BSA封闭1 h，加入适当稀释的一抗，4℃摇床过夜，TBST缓冲溶液洗膜3次，每次10 min，再加入适当稀释的二抗，室温摇床结合1 h，TBST缓冲溶液洗膜三次后置于显影液中，显色、曝光。

2.5 统计学方法

数据均以平均值±标准误（mean± SEM）表示，使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析，应用单向方差分析（ANOVA）和Bonferroni方法分析组差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞免疫荧光标记

与对照组比较，C.C＋α-生育酚组的橙色溶酶体数量明显增加（见图A）。

图A α-生育酚对橙色溶酶体的影响[图1-3（10X）；图4-6（40X）]

3.2 透射电镜观察自噬体

按设定分组处理后，C.C预处理组自噬体数量显著降低（P＜0.01），而α-生育酚增加了自噬体的数量（见图B、C）。

图B/C α-生育酚对自噬体数量的影响

3.3 Western Blot 检测结果

α-生育酚通过抑制HT22细胞中mTOR激酶的表达而诱导自噬（见图D）。与对照组相比，预处理α-生育酚能够显著降低由C.C诱导的LC3-Ⅱ的表达（a，P＜0.01），上调了P62的表达（b，P＜0.001）。α-生育酚能够激活胞内p-AMPK的表达，但不能逆转C.C对p-AMPK表达的抑制（c，相对于CTL组，P＜0.01；相对于C.C组，P＞0.05）。α-生育酚可以下调p-mTOR的表达（d，相对于C.C组，P＜0.05；相对于CTL组，P＜0.01）。C.C抑制ULK1的表达（e，P＜0.05，相对于CTL组）；α-生育酚能够逆转C.C对ULK1激酶的抑制作用，提高其表达水平（e，P＜0.05）。

图D α-生育酚作用HT22细胞后相关蛋白表达的变化

4 讨论

LC3的表达水平与自噬相关[13]，刺激自噬体的形成与抑制自噬体的降解均可导致LC3-Ⅱ表达水平升高。LC3-Ⅱ参与了自噬的全过程，能与新形成的膜相结合，直到自噬溶酶体的形成，其相对量与自噬体含量相关，其表达水平间接反应了自噬水平的高低[14]，这种LC3亚型也是目前检测自噬体时最常用的分子标记之一。我们发现LC3-Ⅱ和LC3-I的总和在同一样品中不一定相同，考虑到LC3抗体对LC3-Ⅱ的亲和力可能高于LC3-Ⅰ，因此我们的研究只考虑了LC3-Ⅱ的水平。经α-生育酚干预后，HT22细胞自噬现象明显增强，表现为AO染色下橙色溶酶体数量明显增多，透射电镜下观察自噬体显著增加，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达上调及p62水平降低。

mTOR是雷帕霉素的靶分子，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可多种蛋白相互作用，主要形成两种不同的蛋白质复合物mTORC1和mTORC2[15]，其中mTORC1参与了ULK1复合物的调控[16]。mTORC1下游有三种不同的途径，包括4EBP1，P70S6K1和S6激酶[17]，其中4EBP1和P70S6K1是mTOR激酶的真核翻译起始因子的两种调节剂。有丝分裂原和生长因子可激活P70S6K1并随后磷酸化S6激酶，激活自噬。活化状态的mTORC1复合体通过磷酸化ULK1、ATG13、ATG101和FIP200组成的ULK1复合体来抑制细胞自噬，降低ULK1激酶的活性；而诱导细胞自噬的信号通过抑制mTORC1激活ULK1复合体，促进自噬的启动[18]。

除mTORC1以外，ULK1复合物的水平还受能量感受器AMPK的调控[19]。随着对AMPK功能及作用机制的研究深入，越来越多的研究发现AMPK可以直接作用于ULK1调控自噬[20]。Compound Cs是AMPK特异性抑制剂[21]，本研究通过Compound C特异性抑制HT22细胞AMPK表达，进而降低细胞自噬水平作为自噬抑制模型，然后予以α-生育酚处理观察其对自噬的影响以及明确α-生育酚自噬信号通路机制。实验结果显示C.C组能降低细胞自噬水平，加入α-生育酚干预后细胞自噬显著提高，细胞内ULK1表达上调，p-mTOR水平下降。但α-生育酚并没有提高AMPK的表达水平，提示AMPK不是α-生育酚诱导自噬的关键分子，其自噬诱导信号机制可能与抑制mTOR/ULK1信号通路有关。综上，α-生育酚可诱导细胞自噬，AMPK不是α-生育酚诱导自噬的关键分子，其信号机制可能与抑制mTOR/ULK1信号通路有关。