生防多粘类芽胞杆菌P1悬浮剂的研制

于稳欠，李宏玉，陈 晨，吴紫燕，宋晓雨，毛伟力*

（1. 上海万力华生物科技有限公司，上海 201203；2. 大理州植保植检站，大理 671000）

多粘类芽胞杆菌P. polymyxa是广泛分布在植物体表和根际土壤的一种革兰氏阳性细菌[1]。它不仅产生抗逆性芽胞，还能产生多种功能性次级代谢产物，已被广泛地应用在植物病害的生物防治、农田施用的生物肥料、盐碱地修复等农业绿色防控、“双增双减”和环境保护等领域[2-4]。美国环保署（EPA）已将多粘类芽胞杆菌作为一种可商用的微生物，我国农业农村部将其列为免做安全鉴定的一级菌种[4]。芽胞杆菌所形成的芽胞对外界的不良环境条件有较强的抗逆性，便于菌剂的生产和加工，有利于储存、运输，以及在不同环境中的存活、定殖和传播[5-7]。目前，我国以多粘类芽胞杆菌作为活性成分登记的生物农药制剂已有10多个，主要用于防治番茄、烟草、辣椒、茄子的青枯病，黄瓜细菌性角斑病，西瓜枯萎病、炭疽病和小麦赤霉病等[8]。

悬浮剂（suspension concentrates，SC）是以水作为稀释剂或分散介质的一种环保型农药剂型，将难溶于水的固体原药经砂磨和各种助剂的作用，使之均匀地分散，形成一种能流动、高悬浮、细小且较稳定的液固相分散体系[9,10]。与可湿性粉剂（WP）相比，SC在生产制作和使用时无粉尘漂移，对人畜及环境安全，同时具有优良的分散性、展着性和流动性等优点；与乳油（EC）相比，SC可避免使用大量的有机溶剂，不易燃、不易爆、低毒、低药害，安全性高[11]。SC是目前最受市场青睐的一种剂型，也是联合国粮食及农业组织（FAO）推荐的环保剂型之一[12]。武汉科诺生物科技股份有限公司开发的5亿CFU/g多粘类芽胞杆菌KN-03悬浮剂，其登记的作物和防治对象分别为：番茄青枯病、黄瓜细菌性角斑病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病；江苏省苏科农化有限责任公司登记的60亿芽胞/mL解淀粉芽胞杆菌LX-11悬浮剂，可防治水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病；江苏常隆农化有限公司登记的80亿CFU/ml 枯草芽胞杆菌悬浮剂，可防治黄瓜白粉病[8]。

在研制开发微生物农药制剂过程中，由于受到微生物自身对外界物理、化学等因素要求的限制，从而在对各种功能助剂进行筛选时，以及在加工设备和制作工艺的选用上，都必须考虑这些限制因素。例如各种助剂对制剂的润湿性、分散性、悬浮率等理化性质上，不仅要达到国家制定的标准，同时在使用这些助剂时还必须尽可能地保持微生物的活性、活性成分的功能释放和较长的货架期。为了开发安全、环保、高效的多粘类芽胞杆菌P1悬浮剂（P1-SC），本研究在充分考虑了以上各限制因素的基础上，进行了多种合理的筛选，为P1-SC的产业化生产提供了可参考的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌：多粘类芽胞杆菌P1 由上海万力华生物科技有限公司（上海万力华）分离、鉴定和保存。该菌株现保藏在中国微生物菌种保藏管理中心（保藏编号CGMCC No.13554）。P1菌粉：含菌量≥10.18 lg cfu/g；P1发酵液：含菌量≥9.18 lg cfu/mL（均由上海万力华提供）；润湿分散剂：500#（十二烷基苯磺酸钙）（江苏茂亨化工有限公司）、MOA-7（脂肪醇与环氧乙烷缩合物）（江苏省海安石油化工厂）、K12（十二烷基硫酸钠）（苏州源泰润化工有限公司）、木钠、NNO（2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐）、Morwet D-425萘磺酸盐缩聚物（均采自南京捷润科技有限公司）、tween-80、OP-10（上海润捷化学试剂有限公司提供）；防腐剂：山梨酸钾（河南旗诺食品配料有限公司）、万立净 C25、BIT20（均采自上海万厚生物科技有限公司）；增稠剂：硅酸镁铝（杭州品赢新材料有限公司）、黄原胶（内蒙古阜丰生物科技有限公司）；防冻剂：丙三醇、乙二醇（均采自南京古田化工有限公司）；紫外（UV）保护剂：黄原胶、VC（河南旗诺食品配料有限公司）、淀粉（赵县裕丰淀粉制品有限公司）、CMC（羧甲基纤维素钠）（上海润捷化学试剂有限公司）；消泡剂（江苏赛欧信越消泡剂有限公司）。

1.2 仪器

电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；立式砂磨机（莱州市科达化工机械有限公司）；剪切乳化机（齐威仪器）；冰箱（青岛海尔股份有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；pH计（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；NDJ-1旋转式粘度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.3 助剂的筛选

1.3.1 润湿分散剂的筛选 对材料中提供的8种润湿分散剂进行初筛，采用流点测试法[13]，试验重复5次。选用流点较小的润湿分散剂，通过粘度曲线法来确定润湿分散剂的最佳用量。以粘度值为纵坐标，润湿分散剂用量为横坐标，绘制粘度曲线。粘度最低值所对应的润湿分散剂用量为最佳用量，并结合悬浮率、活菌数进行指标测试。

生物相容性：分别取上述润湿分散剂1 mL或1 g，加入到49 mL的P1发酵液中，混合均匀，以不加润湿分散剂发酵液为对照，每个处理3个平行，36 ℃培养2 d，比较不同的润湿分散剂对P1菌含量的影响。

1.3.2 增稠剂的筛选 在已筛选出的润湿分散剂的基础上，分别添加0.10%、0.15%、0.2%黄原胶，0.5%、0.75%、1.0%硅酸镁铝，以及 0.15%＋0.5%、0.15%＋0.75%、0.15%＋1.0%黄原胶与硅酸镁铝的复合，有效成分和其他助剂百分比相同。将P1-SC样品在（54±2）℃热贮14 d后，测试各样品的流动性、析水率以及分层状况、活菌数。

1.3.3 UV保护剂的筛选 将黄原胶、VC、淀粉、CMC按0.1%的比例加工成不同的P1-SC样品，搅拌均匀后稀释涂布在PDA平板上，每个处理重复3次，以不加UV保护剂为对照，并放置在距离紫外灯60 cm处，照射时间分别为0.5、1和2 h，置于36 ℃恒温培养，2 d后统计活菌数。

1.3.4 防腐剂的筛选 选择与P1生物相容性较好的山梨酸钾、万立净C25和BIT20，用量分别为0.1%、0.2%、0.3%，其他成分保持不变，加工成不同的P1-SC样品，取100 mL样品放置在250 mL的三角瓶中常温贮存7、14 d后，观察样品有无霉变和异味，根据霉层大小（霉层占三角瓶内样品液面的面积）和变质情况筛选最优防腐剂和用量。

1.3.5 防冻剂的筛选 将上述筛选出的润湿分散剂、防腐剂、增稠剂以及紫外保护剂与 P1混合，配制成P1-SC样品后，分别将1%、2%、3%的乙二醇、丙三醇加入制剂中，放置在（-4±2）℃ 贮存7 d，测定样品悬浮率、流动性、菌含量以及析水率。

1.4 正交试验

根据上述结果对关键因素500#、MOA-7、硅酸镁铝、丙三醇的用量进行正交试验优化，其他成分保持不变。试验共设上述4个因素，每个因素设3个水平，采用L9(34)正交设计表（表1）。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test of factor and level

1.5 悬浮剂的制备及质量检测

按照流程图1进行悬浮剂的制备，将称量好的0.15%黄原胶中加入3%的丙三醇，搅拌均匀，让黄原胶充分溶胀，至完全溶解，备用。将2.5% 500#、2.5% MOA-7、0.75%硅酸镁铝、0.15%黄原胶、3%丙三醇、0.2%万立净C25、0.3%消泡剂，软水补足至100%，经剪切乳化机高速搅拌均匀后经砂磨机砂磨2～3 h，再加入10% P1菌粉剪切搅拌均匀后经过滤（100目）获得P1-SC。

图1 P1-SC制备工艺流程图Fig. 1 Flowchart of the process for preparation of P1-SC

对菌剂的质量指标测定方法如下：参照GB/T 1601—1993方法[14]测定pH；参照GB/T 14825—2006方法[15]测定悬浮率；参照GB/T 19136—2003方法[16]测定热贮稳定性；参照GB/T 19137—2003方法[17]测定冷贮稳定性；参照GB/T 31737—2015方法[18]测定倾倒后残余物和洗涤后残余物；参照GB/T 28137—2011方法[19]测定持久起泡性；参照GB/T 16150-1995方法[20]中的“湿筛法”进行湿筛试验；析水率的测定即取5 mL的待测液置于离心机中，以3000 r/min离心30 min后取出，观察析水的体积，其中析水体积＜5%时为合格，析水体积＜1%或无析水时为最佳，当析水体积＞5%为不合格[21]。

1.6 数据统计与分析

采用Excel 2007进行图表绘制，数据统计与显著性差异分析采用SPSS Statistics 17.0和单因素ANOVA方差分析。

2 结果与分析

2.1 润湿分散剂的筛选

8种润湿分散剂进行流点和生物相容性测试结果表明，流点在1.0以下的润湿分散剂可用于菌剂P1-SC的制备。500#、MOA-7以及K12、木钠可作为本制剂的润湿分散剂，但木钠对P1的活性影响较大，而500#、MOA-7、K12对P1生长活性影响较小（表2）。因此，选择500#、MOA-7、K12 作为最佳用量筛选对象。

表2 润湿分散剂的筛选结果Table 2 Results of the screening test for wetting dispersants

添加了不同比例的500#（A）、MOA-7（B）、K12（C）粘度曲线图2可以看出，粘度均随着润湿分散剂用量的增加，表现出先降低后增大的趋势；而悬浮率则正好相反，表现出先增大后下降的趋势；当500#的用量为 2%～3%时，粘度最低为 225～281 mPa·s，悬浮率最高为 97.5%～98.6%；当 MOA-7的用量为2.5%～3.5%时，体系粘度最低为246～322 mPa·s，悬浮率最高为97.6%～98.4%；当 K12的用量为1%时，体系粘度最低为287 mPa·s，悬浮率最高为97.8%。由于K12在砂磨过程中出现大量泡沫，故选择500#、MOA-7进行后续试验。

图2 不同含量的润湿分散剂500#、MOA-7、K12对P1-SC黏度的影响Fig. 2 Effects of different contents of wetting dispersants 500#, MOA-7 and K12 on the viscosity of P1-SC

2.2 增稠剂的筛选

增稠剂的筛选结果见表3，P1-SC在分层状况、流动性及析水率方面，黄原胶表现出较好的效果，优于硅酸镁铝，但二者复配效果优于二者单一使用。二者复配得到的产品出现分层现象概率较低，且流动性和析水率均最佳，最终选用黄原胶复配硅酸镁铝作为P1-SC的增稠剂。

表3 增稠剂的筛选结果Table 3 Result of the screening test for thickeners

2.3 紫外保护剂的筛选

UV保护剂的筛选结果见表4，UV辐射30s后，经黄原胶、CMC、淀粉以及VC处理的P1-SC、P1芽胞数均保持在9.18 lg cfu/mL以上，其中，经黄原胶处理的P1的芽胞数（9.26 lg cfu/mL）显著高于CK处理（9.15 lg cfu/mL）；UV辐射1 h后，经CMC、淀粉以及VC处理的P1芽胞数急剧下降到9.10 lg cfu/mL及以下，显著低于经黄原胶处理的P1的芽胞数（9.21 lg cfu/mL）；UV辐射2 h后，经黄原胶、CMC和淀粉处理的P1的芽胞数（≥9 lg cfu/mL），显著高于CK处理（8.83 lg cfu/mL）。筛选结果表明，黄原胶不仅能降低UV对P1活性的影响，还能在SC中作为增稠剂，故选择黄原胶作为P1-SC的UV保护剂。

表4 UV保护剂筛选结果Table 4 Result of the screening test for UV protectants

2.4 防腐剂的筛选

筛选结果表明，与山梨酸钾、BIT20相比较，加入0.2%～0.3%万立净C25防腐效果更好，P1-SC中无霉层、无异味；而加入0.20%山梨酸钾处理14 d后，P1-SC中有少许异味，霉层面积达1/6，加入BIT20对P1-SC没有起到防腐效果（表5）。

表5 防腐剂的筛选结果Table 5 Result of the screening test for preservatives

2.5 防冻剂的筛选

筛选结果表明，加入2.0%～3.0% 的乙二醇或丙三醇，P1-SC在-4 ℃没有出现冰水混合现象，而丙三醇在悬浮率、流动性等方面的效果好于乙二醇，且样品中无析水现象（表6）。

表6 防冻剂的筛选结果Table 6 Results of the screening test for antifreeze

2.6 消泡剂用量的选择

本试验中，只对有机硅消泡剂的用量进行测试结果表明，有机硅消泡剂的最佳使用量为0.3%，对P1-SC的消泡效果较好，热贮测试后合格。

2.7 正交试验优化配方

通过正交设计方案，产品经（54±2）℃热贮14 d的悬浮率≥90%，活菌数≥9.18 lg cfu/mL。得到正交试验最优方案为A2B1C2D3，即最优添加助剂组合为2.5% 500#、2.5% MOA-7、0.5%硅酸镁铝、3%丙三醇（表7）。该组合经热、冷贮后未出现析水、分层以及凝固等现象。

表7 润湿分散剂正交试验方案及各项指标测定结果Table 7 Orthogonal test of wetting and dispersing agents

2.8 P1-SC制剂质量及货架期检测结果

P1-SC外观为棕色液体，贮存过程中性状良好，P1-SC的芽胞含量 9.29 lg cfu/mL；pH 6.2，杂菌率为1.03%，细度（≤75 µm）通过率98.5%，持久泡沫量（1 min 后）为3 mL，悬浮率为98.0%，倾倒后残余物质量分数0.64%，洗涤后残余物质量分数0.25%（表8）。冷热及常温条件下6个月后，活菌数在9.18 lg cfu/mL以上（图3）。

表8 P1-SC产品质量检测结果Table 8 Result of quality control test for P1-SC

图3 P1-SC在不同温度储存条件下6个月后的有效活菌数Fig. 3 The viable spores of P1-SC stored under different temperatures for 6 months

3 讨论

我国从20世纪70年代开始研制悬浮剂，到21世纪初，已在制剂配方、加工工艺和产品种类、数量等方面，都获得了较大的发展[9]。但与发达国家如：美国、英国等所开发和应用的 SC产品相比，我国生产的 SC，还存在着与物理稳定性相关的一些问题，如在贮存过程中易发生分层、沉淀，有效成分分布不均匀，以及易结块等现象，影响了SC类产品在农业生产中的推广和应用[22]。近10多年来，随着砂磨工艺技术和设备的不断完善，配合先进的检测仪器，以及高品质分散剂、润湿剂等新型高效添加剂的应用，SC已成为含有多种类农药活性成分[23]，深受广大用户喜爱的剂型之一。将本研究开发的P1-SC用于对广东菜心根肿病防治的室内药效试验结果表明（已录用，未发表），P1-SC对菜心根肿病的防治效果与用药浓度呈正相关。当施用P1-SC 稀释到6.0 lg cfu/mL时，对菜心根肿病的防治效果为83.0%，与化学农药500 mg/L氟啶胺SC的防治效果（100.0%）没有显著性差异，但显著性高于（P≤0.05）一种商用枯草芽孢杆（7.3 lg cfu/mL）的防治效果（29.8%）。

SC剂型通常是由制剂中的活性成分与添加的各种助剂混合后，通过湿法研磨并搅拌，使之均匀分散悬浮在水中，形成稳定的悬浮液体，平均粒径为：＜5 μm[10]。谢兰芬等[24]在研究解淀粉芽胞杆菌B9601-Y2悬浮剂的工艺时均使用了砂磨机，而多粘类芽胞杆菌的芽胞大小为（2～5 μm）×（0.6～0.8μm）[25]，本研究试验发现，在砂磨过程中会造成P1-SC部分芽胞的损伤，因此将制作工艺调整为只对所用的助剂进行砂磨后，再加入P1菌粉进行剪切搅拌，以获得无损伤P1芽胞的SC产品。UV辐射对活体微生物有一定的杀伤作用，是影响生防制剂田间应用效果的重要因素之一，在生防制剂中加入一定量的UV保护剂来提高活体微生物在应用环境中的存活率，是一种常用手段[26]。本试验结果表明，黄原胶能较好地防护P1芽胞免于来自UV的影响，与张俊祥等[27]在解淀粉芽胞杆菌GB1水悬浮剂的研究结果一致，当紫外灯照射1 h后，加入了黄原胶的P1-SC，其活菌数仍保持在9.18 lg cfu/mL以上。SC是一种水分散体系，当 SC产品中所加入的助剂含有一定的营养成分，容易被外界多种杂菌或生防菌自身所利用，导致制剂的平衡体系被破坏[24]。为防止此现象的出现，制剂中需加入合适的防腐剂。易敏等[28]研制的斜纹夜蛾多角体病毒悬浮剂的pH 6～8，并筛选出酸性的苯甲酸钠作为该制剂的防腐剂。本研究结果显示，在P1-SC制剂中添加0.10%～0.30%的BIT20没有起到防腐效果，而将酸性的万立净C25作为P1-SC的防腐剂，能明显抑制杂菌污染。