羊奶源产细菌素乳酸菌筛选、鉴定及益生特性研究

杨珍珠，潘秭琪，迟 海*，陶乐仁

（1 上海理工大学健康科学与工程学院 上海200093 2 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海200090 3 大连海洋大学食品科学与工程学院 辽宁大连116023）

益生菌是一类具有改善宿主新陈代谢，增强免疫力，调节肠道菌群作用的活体微生物，当宿主摄入一定量益生菌时可以对宿主发挥有益作用[1]。由于乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）被普遍认定为安全的微生物，同时其具有在低pH 值条件下存活、黏附能力强、产抑菌物质等特性，因此大多数乳酸菌常被看作益生菌[2]。其中，嗜热球菌、乳球菌、肠球菌、乳杆菌等都是当前研究较广、商业化集中的菌种[3-6]。

乳酸菌在生长过程中会产生许多抑菌物质，其中由乳酸菌核糖体合成产生的一类抑菌肽，命名为细菌素，对其亲缘较近的细菌有高效的抑制作用。也有部分细菌素具有广谱抑菌活性，可抑制食品腐败菌和致病菌[7]。与其它抑菌物质不同，细菌素的抑菌作用具有特异性，对它的靶细菌具有高效的杀灭作用[8]。此外，细菌素具有热和酸碱耐受，在体内易降解、安全、无残留的特点[9]。筛选产细菌素的乳酸菌，分析其潜在的益生特性，对于预防和治疗某些特定致病菌引起的肠道疾病具有重大的意义。

本研究以羊奶源中提取乳酸菌为指标菌，以3 种常见的食源性致病菌【单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）】为指示菌，筛选具有抑制上述食源性致病菌活性的乳酸菌，并对其进行分子、生化等特性分析。同时，通过模拟胃肠液的耐受性、聚集性试验，探讨羊奶源中筛选出的乳酸菌的益生特性，旨在对产细菌素的乳酸菌的益生性能进行评价，为微生态制剂开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

单增李斯特菌LFM2813、金黄色葡萄球菌LFM3263、蜡样芽孢杆菌LFM2805、乳酸乳球菌LFM2122（Lactococcus lactisLFM2122）、大肠埃希氏菌LFM3704（Escherichia coliLFM3704），由中国水产科学研究院东海水产研究所保存。

1.2 培养基与试剂

鲜羊奶购于陕西渭南；脑心浸液培养基（Brain Heart Infusion，BHI），美国BD 公司；MRS 培养基、兔血清平板，北京陆桥技术有限责任公司；M17 培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司，甘油、矿物油、盐酸、多黏菌素B、牛胆盐、氯霉素、胰蛋白酶、胃蛋白酶、乳糖，国药集团（上海）化学试剂有限公司；琼脂糖，美国Invitrogen 公司；琼脂粉、硫酸链霉素、氨苄青霉素、β-半乳糖苷酶试剂盒，北京索莱宝公司；呋喃妥因、萘啶酮酸，生工（上海）生物工程股份有限公司；DNA 提取试剂盒、Taq 酶，Takara 公司；API 50CH 细菌糖代谢试剂盒，法国梅里埃公司。

1.3 主要仪器与设备

YXQ-LS-50SII 立式灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗器械厂；MIR-153 恒温培养箱，日本三洋（SANYO）电机公司；SW-CJ-2FD 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；水平电泳槽及成像系统，美国Bio-rad 公司；DK-524 水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；TG16WS 高速离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；PHS-2F pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；普通PCR 仪，美国thermo 公司；XY300C 电子天平，常州市幸运电子设备有限公司；QT-2 旋涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司；Power Wave XS 酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 乳酸菌筛选 无菌条件下将25 mL 鲜羊奶溶解于225 mL 生理盐水中，均质后静置30 min，进行梯度稀释，将100 μL 样品涂布在预先添加多黏菌素B（0.5 g/mL）的MRS 和LM17（M17 培养基中加入0.5%的乳糖）培养基上，30 ℃无氧条件下培养48 h 后选取培养基中的单菌落接种至LM17液体培养基中，厌氧条件下30 ℃过夜培养。通过革兰氏染色，过氧化氢酶反应和pH 值测定对乳酸菌进一步筛选，将筛选出的菌株划线并在体积分数13%甘油中保存。

1.4.2 抑菌活性测定 以3 种食源性致病菌（单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌）为指示菌株，以筛选出的乳酸菌为指标菌，根据琼脂扩散法，参考迟海等[10]的方法，筛选具有抑菌活性的乳酸菌。

1.4.3 抑菌稳定性测定 将有抑菌活性的指标菌在30 ℃下培养过夜后，10 000 r/min 条件下离心30 min，收集上清液，利用0.22 μm 膜去除残留的细菌，将上清液置于100 ℃水浴10 min，参考Chi等[11]的方法，利用96 孔板微量稀释法，测定指标菌的抑菌情况。

将指标菌在30 ℃过夜培养后，根据琼脂扩散法，参考迟海等[10]的方法，判断酶试剂（20 μg/mL的蛋白酶K 和1 mg/mL 的胰蛋白酶）对抑菌物质活性的影响。

1.4.4 基因组DNA 提取、PCR 扩增及菌种鉴定使用细菌基因组DNA 提取试剂盒对有抑菌活性的指标菌的DNA 进行提取，以提取的细菌基因组DNA 为模板，以12F：5'- AGGGTTGCGCTCGTTG-3' 和15R：5'-TACGGGAGGCAGCCAG-3' 为引物进行PCR 扩增，扩增条件为：94 ℃、2 min；94 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 个循环；72 ℃、5 min。然后将扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.4.5 基因组重复序列PCR 基因组重复序列PCR（Repetitive extragenic palindromic PCR，rep-PCR）参考Silva 等[12]的方法，以具有抑菌活性的指标菌的基因组学DNA 为模版，以BOX：5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′为引物，使用Taq 酶试剂，建立20 μL 扩增体系进行扩增。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶下电泳并在UV 灯下观察电泳结果。

1.4.6 溶血性试验 参照Nayak 等[13]的方法对具有抑菌活性的指标菌进行溶血性分析。将指标菌在兔血清平板上划线，以蜡样芽孢杆菌为对照，30℃下培养24 h 后观察。

1.4.7 对抗生素的耐受性测定 参考Nallala 等[14]的方法，采用琼脂扩散法对有抑菌活性的指标菌的耐药性进行测定。

1.4.8 糖代谢能力的测定 参考迟海等[10]的方法对指标菌的糖代谢能力进行测定。

1.4.9 对胆盐耐受能力的测定 将不同质量分数的牛胆盐（0，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%）加入BHI 液体培养基中后灭菌，指标菌按4%的接种量接种于BHI 液体培养基中，30 ℃有氧条件下过夜培养后测定OD600nm。参考贾丽艳等[15]的方法判断具有抑菌活性的指标菌的胆盐耐受能力。

1.4.10 对模拟胃肠液耐受能力的测定 参考刘海天等[16]的方法对筛选的指标菌进行模拟胃肠液耐受能力的测定。将指标菌接种于BHI 液体培养基中，30 ℃培养过夜后于3 500 r/min 条件下离心15 min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，彻底除去培养基后保存备用。取50 mL pH 值为2.5，3.0，3.5 的无菌生理盐水（含1%的胃蛋白酶）模拟人工胃液。取100 mL 0.68%的无菌KH2PO4溶液（含1%胰蛋白酶）模拟人工肠液。将制备好的细菌用人工胃肠液重悬，37 ℃培养，每隔1 h 测其培养液OD600nm值。

1.4.11 抑菌性质鉴别 用70%饱和硫酸铵沉淀对有抑菌活性的指标菌的细菌素进行粗提。参考Chi 等[11]的方法，用96 孔板微量稀释法，测定细菌素粗提物对单增李斯特菌的抑菌性质，并绘制OD600nm-t的生长曲线。

1.4.12 细菌的自聚集和共聚集性分析 参考

1.4.10 节的方法收集具有抑菌活性的指标菌、单增李斯特菌、大肠埃希氏菌，用磷酸缓冲液（PBS，pH 6.8）重悬，使细菌浓度为108CFU/mL。参照孙群等[17]和Reuben 等[18]的方法评价具有抑菌活性的指标菌的自聚集性和共聚集性。

1.4.13 β-半乳糖苷酶活性测定 采用β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒进行活性测定，β-半乳糖苷酶的活力用U/104细胞表示。

1.4.14 数据分析 使用Excel 软件对试验数据进行分析并通过Origin 2018 作图。PCR 扩增产物鉴定后所得序列在NCBI 中的BLAST 检索系统数据库中进行比对确定。

2 结果与分析

2.1 产细菌素乳酸菌的筛选

乳酸菌具有革兰氏染色阳性、过氧化氢酶反应阴性、产酸的特点。从羊奶中共筛选出46 株符合上述特征的乳酸菌，并将全部的乳酸菌作为指标菌，筛选可以抑制单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的乳酸菌，发现3 株潜在产细菌素的乳酸菌（命名为DH9003、DH9011、DH9012）可以抑制上述食源性致病菌。

2.2 乳酸菌的抑菌稳定性测定

由于乳酸菌具有产有机酸、细菌素等抑菌物质的特性。细菌素具有热稳定性强，易被蛋白酶分解的性质，根据这一特性可对指示菌的抑菌物质进行验证。表1 是在分别经过热和酶处理后的细菌素的抑菌稳定性。结果显示，经热处理后的细菌素都保留抑菌活性。然而，蛋白酶处理后的细菌素抑菌活性丧失。这一结果验证了筛选的3 株乳酸菌产的抑菌物质具有细菌素的基本特性。

表1 不同处理后乳酸菌细菌素的抑菌稳定性情况Table 1 Antibacterial stability of bacteriocins produced by LAB via different treatments

2.3 产细菌素的乳酸菌的鉴定结果

通过与数据库进行同源性比对，发现乳酸菌DH9003 为粪肠球菌（Enterococcus faecalis），乳酸菌DH9011 为乳酸乳球菌（L.lactis），乳酸菌DH9012 为粪肠球菌，且上述乳酸菌鉴定结果与数据库比对相似度都达到99%以上。

2.4 产细菌素乳酸菌基因组重复序列差异分析

为了确定同一种属的细菌基因型是否一致，本试验通过利用特殊引物即BOX 对筛选出的乳酸菌的DNA 进行基因组重复序列PCR 扩增，确定其相应的基因图谱，以便进行进一步区分。图1为3 株产细菌素的乳酸菌的rep-PCR 电泳图。结果显示，2 株粪肠球菌PCR 扩增产物不同，且与乳酸乳球菌PCR 扩增产物存在较大差异，这说明3株乳酸菌的基因同源性较低。

图1 3 株产细菌素乳酸菌rep-PCR 扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretic map of rep-PCR products of three bacteriocin producing lactic acid bacteria

2.5 产细菌素乳酸菌的抑菌性质

图2 分别是DH9003、DH9011、DH9012 对单增李斯特菌的抑菌生长曲线。结果显示，3 株乳酸菌细菌素的添加量为MIC50、4MIC50时，都能对单增李斯特菌产生一定程度的抑制作用，然而随着时间的延长，单增李斯特菌重新生长。这说明低质量浓度（MIC50和4MIC50）细菌素可以阻止单增李斯特菌生长。当乳酸菌DH9003 和DH9012 细菌素的质量浓度达到16MIC50时单增李斯特菌不生长，这说明高质量浓度条件下DH9003 和DH9012 产生的细菌素可以对单增李斯特菌完全抑制。

图2 不同质量浓度的3 株乳酸菌细菌素对单增李斯特菌的抑菌生长曲线Fig.2 Bacteriostatic growth curve of bacteriocin produced by three lactic acid bacteria on L.monocytogens at different mass concentrations

2.6 产细菌素乳酸菌的益生特性分析

3 株产细菌素乳酸菌的糖代谢能力如表2所示。同其它乳酸菌的糖代谢能力相似，3 株乳酸菌可以代谢葡萄糖等碳水化合物。然而，DH9003 对D-木糖、山梨醇、苦杏仁苷、淀粉、D-塔格糖、葡萄糖酸盐的代谢能力不显著，DH9011对L-阿拉伯糖、山梨醇、α-甲基-D-甘露糖苷、蜜二糖、D-塔格糖、葡萄糖酸盐的代谢能力不显著，DH9012 对D-木糖、α-甲基-D-甘露糖苷、苦杏仁苷、蜜二糖、海藻糖、淀粉代谢不显著。糖代谢试验结果表明3 株产细菌素乳酸菌糖代谢能力不同，同源性较低。

表2 3 株乳酸菌糖代谢能力比较Table 2 Comparisons on glucose metabolism of bacteriocin produced by three lactic acid bacteria

益生菌在肠道发挥益生作用，需经受住胃、小肠液对它的破坏才能在肠道中存活和增殖。同时，十二指肠中的胆汁酸盐对外源细菌有抑制作用，菌体只有具备较高的胆盐耐受性才能保持足够的活菌数，从而发挥益生作用[19]。由表3 可知，3株乳酸菌在胆盐环境下都能保持大量活菌，因此认为3 株乳酸菌均能适应肠道胆盐环境。另外，乳酸菌在动物胃肠道中存活和增殖的另一个瓶颈是胃液的低酸、胃蛋白酶以及肠液的胰蛋白酶对菌体的破坏作用[20]。试验结果表明3 株乳酸菌均能保持存活，说明3 株乳酸菌可以耐受肠道和不同pH 值条件（2.5，3.0 和3.5）下的胃液环境。

表3 产细菌素乳酸菌的益生菌特性研究Table 3 Probiotic properties of bacteriocin produced by lactic acid bacteria

自聚集与共聚集是益生菌的重要性质，它反应了在肠道上皮细胞上形成生物膜的能力，且益生菌和肠道病原菌的结合有助于抗菌物质对病原菌的杀灭[21]。试验结果表明3 株乳酸菌有较好的自聚集性，范围集中在30%～55%。在单增李斯特菌和大肠杆菌的共聚集性试验中，粪肠球菌DH9003和DH9012 相对较高，分别为52.6%，63.2%和68.5%，57.6%，而乳酸菌DH9011 与单增李斯特菌的共聚集性为15.6%，与大肠杆菌不聚集，说明粪肠球菌DH9003 和DH9012 可能有较好的黏附潜力。

乳糖不耐症是由于十二指肠内膜缺乏β-半乳糖苷酶所致，3 株产细菌素乳酸菌都具有β-半乳糖苷酶活性，这有助于缓解乳糖不耐症的现象。同时这3 株乳酸菌都无溶血性（γ 溶血），对人体安全。最后，在对抗生素耐受性的测定中发现，3株乳酸菌都对氨苄青霉素（50 mg/mL）和硫酸链霉素（100 mg/mL）敏感，对氯霉素（2.5 mg/mL）、萘啶酸（10 mg/100 mL）和呋喃妥因（10 mg/100 mL）不敏感。

FAO/WHO 标准认定的益生菌必须满足3 个基本特点：耐受胃肠黏膜的选择环境、黏附宿主的肠壁细胞、分泌物或者分解产物为抗菌物质[22]。本试验中从羊奶中分离的3 株乳酸菌产生可以抑制常见的食源性致病菌的细菌素，对胃肠道环境耐受，具有良好的黏附能力。同时，这3 株乳酸菌安全（无溶血性）、可控（无耐药性），具备益生菌的潜在特质。

3 结论

本研究通过对羊奶中提取的46 株乳酸菌进行抑菌试验分析，获得3 株可以同时抑制单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌的乳酸菌。经过16S rDNA 分子鉴定，这3 株乳酸菌分别鉴定为粪肠球菌（DH9003 和DH9012）和乳酸乳球菌（DH9011）。rep-PCR 和糖代谢能力分析结果表明，3 株乳酸菌在基因型和表现型上存在一定差异。此外，这3 株乳酸菌所产细菌素在低质量浓度（MIC50、4MIC50）条件下可以阻止单增李斯特菌生长，且DH9003 和DH9012 产生的细菌素在高质量浓度条件下（16MIC50）对单增李斯特菌有完全抑制作用。重要的是，这3 株细菌素乳酸菌具有安全（无溶血性）、可控【对氨苄青霉素（50 mg/mL）和硫酸链霉素（100 mg/mL）敏感】的特点。同时，3株乳酸菌能适应胆盐、模拟肠道和不同胃液条件（pH 分别为2.5，3.0，3.5）的环境，具有较好的自聚集性，自聚范围集中在30%～55%，DH9003 和DH9012 与单增李斯特菌和大肠埃希氏菌有较好的共聚集性，范围集中在50%～70%，而DH9011与单增李斯特菌共聚集性差（15.6%），与大肠埃希氏菌不聚集。最后，3 株乳酸菌还具有较高的β-半乳糖苷酶活力。试验结果发现，3 株乳酸菌具有较强抑菌能力，且具备良好的模拟胃肠液耐受性和黏附肠道的能力，符合益生菌的潜在特征，为进一步开发益生菌资源和后期益生菌的体内试验提供了理论基础。