分散固相萃取-气相色谱法测定鸡蛋中氟虫腈及其代谢物

郝莉花,贾利平

1(河南省产品质量监督检验院,河南 郑州,450047) 2(河南省食品安全数据智能重点实验室,河南 郑州,450047)

氟虫腈是一种高活性的苯基吡唑类杀虫剂[1]。氟虫腈在鸡蛋中残留可能的原因主要是在家禽饲养过程中,饲养人员违规使用了氟虫腈来防治跳蚤、虱子等有害生物[2],或使用了受氟虫腈污染的饲料,导致氟虫腈通过母体迁移并蓄积在鸡蛋中。

氟虫腈是目前水稻上使用的主要杀虫剂之一,具有良好的杀虫效果。但该农药及其代谢物在水和土壤中降解缓慢[3-4],对水生生物、家蚕、蜜蜂等都具有较强的毒性,对生态环境造成一定的影响。动物研究表明,氟虫腈在生殖发育毒性、慢性毒性、神经毒性和致癌性实验方面均有一定的不良作用[5]。各国陆续限制其使用,并规定了氟虫腈在食品中的最大残留量[6-7],其中欧盟规定氟虫腈和氟虫腈砜总计的最大残留限量值仅为0.005 mg/kg[8]；国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission,CAC)规定禽蛋中氟虫腈的最大残留限量值为0.02 mg/kg,禽肉中则为0.01 mg/kg[8]。2009年我国农业部公告第1157号[9]规定自2009年10月1日起,除卫生用杀虫剂、玉米等部分旱田种子包衣剂外,在我国境内停止销售和使用用于其他方面的含氟虫腈成分的农药制剂。GB 2763—2021[10]《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定：氟虫腈在玉米及鲜食玉米中最大残留量不得超过0.1 mg/kg,在谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、糖类和食用菌中最大残留限量不得超过0.02 mg/kg；但对鸡蛋中氟虫腈最大残留限量没有规定。

2017年7月，比利时食品安全监管部门在鸡蛋中检出氟虫腈及其代谢产物，成为第一个向欧盟食品安全警戒系统通报“毒鸡蛋”事件的欧洲国家。同年8月，荷兰、德国等欧洲16国及韩国等地更是爆出大规模氟虫腈污染鸡蛋的食品安全事件，造成恶劣影响。自此，有关鸡蛋中氟虫腈再次引起人们的高度关注。GB 2763—2021[11]《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定了氟虫腈在蛋类中的最大残留量残留限量为 0.02 mg/kg，标志残留物为氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜和氟虫腈砜。指定检验方法为GB 23200.115—2018[12]《食品安全国家标准 鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》，因其使用的仪器为液相色谱-质谱联用仪，对仪器设备的要求比较高，不利于方法在基层检验机构的广泛推广。近年来，关于鸡蛋中的氟虫腈的方法研究，大多采用质谱分析上，如采用气相色谱-质谱法[13-14]、液相色谱-串联质谱法[15-16]，对于采用成本较低的气相色谱仪的研究较少。

在前处理方法上，由于鸡蛋基质本身成分复杂，含有多种杂质而不能直接检测氟虫腈及其代谢物[17-18]，QuEChERS净化具有快速(Quick)、简单(Easy)、廉价(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)及安全(Safe)的优点，是目前大部分农兽药残留量常用的前处理方法之一[19]，该法可较好地应用于零脂肪或低脂肪样品(如：牛奶、鸡蛋、蔬菜和水果等)的农兽药残留检测。

本研究通过对分散固相萃取净化材料及其配比的优化，采用气相色谱法检测，以期得到一种有效降低或消除鸡蛋中蛋白、脂肪等基质干扰，并具有分析速度快、检测成本较低、对仪器要求较低等优势的鸡蛋中氟虫腈及其代谢物测定的方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与设备

7890A气相色谱仪(配有ECD检测器)、HP-5色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),安捷伦科技有限公司；FA2004 N电子天平,上海箐海仪器有限公司；B-400均质机,瑞士步琪有限公司；QL-866涡旋混合器,Vortex Mixer公司。

1.2 试剂与材料

氟虫腈标准物质(纯度均≥99%),德国Dr·Ehrenstorfer公司；乙腈(色谱纯),德国Merck公司；氯化钠、无水硫酸钠(分析纯),天津市永大化学试剂有限公司。

鸡蛋：市售。

1.3 仪器参数

HP-5色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent,美国)；进样口温度280 ℃；进样方式：不分流进样；升温程序：初始温度60 ℃,保持2 min,以10 ℃/min升温至240 ℃,保持2 min；进样量1 μL；载气：氮气；载气流速1 mL/min(恒流)。

1.4 标准溶液的配制

1.4.1 标准储备溶液

取100 mg/L的氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜标准物质溶液,用乙腈做溶剂配制成质量浓度均为10 mg/L的氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈、氟虫腈亚砜标准储备液,储存于-18 ℃冰箱待用。

1.4.2 标准使用溶液

分别准确吸取氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜标准储备溶液50、100、200、500、800 μL以及1、2 mL至100 mL容量瓶中,用溶剂定容,配制成质量浓度0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2 g/L的混合标准溶液。

1.5 样品制备与前处理

1.5.1 样品制备

空白样品：取兽残阴性样品鸡蛋约1 000 g,洗净去壳,用组织均浆机充分搅拌均匀,置于聚乙烯瓶中备用。

0.5 mg/kg加标样品：称取空白样品100 g,准确加入1.4.1中配制的10 mg/L混合标准储备液5 mL,均质,配制成0.5 mg/kg的加标样品。

1.5.2 样品前处理

方法1(不净化)：称取2 g样品于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈,加入2 g NaCl,涡旋振荡1 min,在6 000 r/min条件下离心5 min,上清液过0.22 μm有机膜,待测。

方法2(Prime HLB净化)：称取2 g均质样品于50 mL离心管中,加入8 mL含0.2%甲酸的80∶20(mL∶mL)乙腈/水溶液,涡旋振荡2 min,超声10 min,在12 000 r/min条件下冷冻离心5 min,取3 mL上清液过Prime HLB柱子,然后收集1 mL滤液过0.22 μm有机膜,待测。

方法3(QuEChERS净化)：称取2 g均质样品于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈,涡旋振荡2 min,超声10 min,再加入2 g NaCl,6 g Na2SO4,涡旋振荡1 min,在6 000 r/min条件下离心3 min,取1 mL上清液在2 mL离心管中,并加入50 mg的乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶(ethylenediamine-N-propylsilylated silica gel，PSA),50 mg的C18,150 mg的MgSO4,涡旋振荡1 min,6 000 r/min条件下离心3 min,上清液过0.22 μm有机膜,待测。

方法4(HLB净化)：称取2 g均质样品于50 mL离心管中,加入10 mL(0.1 mL/L)的EDTA-MCLLVAINE缓冲液,涡旋振荡2 min,超声10 min,在10 000 r/min条件下冷冻离心5 min,取上清液备用,再加入10 mL(0.1 mL/L)的EDTA-MCLLVAINE缓冲液,涡旋振荡2 min,超声10 min,在10 000 r/min条件下冷冻离心5 min,合并2次提取液,取2 mL提取液过HLB柱子(预先用6 mL甲醇6 mL水活化),然后加入2 mL的5%甲醇淋洗液淋洗,2 mL甲醇溶液洗脱,氮吹吹干后用乙腈定容到1 mL,过0.22 μm有机膜,待测。

1.6 基质效应计算

方法基质效应按照公式(1)[20]计算：

(1)

式中：ME,前处理过程总基质效应,%；SA,目标化合物在纯溶剂基质中检测的峰面积；SB,目标化合物经过前处理后处理液基质中检测的峰面积。

2 结果与分析

2.1 色谱柱选择

目前,在国内市场上销售的商品GC毛细管色谱柱的生产厂家主要有安捷伦公司(Agilent)、奥泰公司(Alltech)、瑞斯泰克公司(Restek)、SGE公司、萨帕克公司(Supelco)等。在这些厂家生产的毛细管色谱柱中以含5%苯基和95%二甲基聚硅氧烷固定相的中等极性色谱柱(HP-5、HP-5MS、DB-5、DB-5MS等)较为常见,其次是100%二甲基聚硅氧烷的固定相的弱极性色谱柱(HP-1、HP-1MS、DB-1、DB-1MS、Rtx-1MS等)和聚乙二醇固定相的极性色谱柱,这些色谱柱的尺寸多为标准型(30 m×0.25 mm×0.25 μm)[27-28]。本实验根据氟虫腈的结构和化学性质选取实验室常用的4种色谱柱,即HP-5、DB-5、DB-1701、DB-1进行上机测定实验,进样质量浓度为0.000 5 μg/mL的氟虫腈工作液,通过比较氟虫腈色谱峰对称因子、信噪比和保留时间确定最佳色谱柱,结果详见表1。

表1 氟虫腈色谱峰参数Table 1 Chromatographic peak parameters of fipronil

由表1可知,HP-5的对称因子为0.88,说明氟虫腈标准品在色谱柱HP-5的峰形较其他3种色谱柱好,其信噪比为7,仪器检出限为0.000 2 μg/mL,说明氟虫腈标准品在色谱柱HP-5上通量高,能够获得最低的检出限；在相同进样浓度条件下,氟虫腈在HP-5上有较长的保留时间,可降低低沸点杂质的干扰。综上分析,本实验采用HP-5弹性石英柱。

配制0.2 μg/mL氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈和氟虫腈砜标准品,采用HP-5弹性石英柱分离检测,4种化合物在色谱柱上基线分离,出峰效果好,色谱图见图1。

图1 氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈和氟虫腈砜色谱图Fig.1 Chromatograms of fluorocarbonitrile,fipronil sulfoxide,fipronil and fipronil sulfone

2.2 净化方式选择

有关净化方式已有较多的文献研究[21]。本研究比较QuEChERS净化、Prime HLB固相萃取柱净化和HLB固相萃取柱净化方式,以确定一种更合适的净化方式。称取1.5.1中0.5 mg/kg加标样品,按照1.5.2所述4种方法处理,经1.3条件检测,数据按照1.6分析,每组实验重复2次,以平均值计,结果见表2。

表2 三种净化方法的总基质效应 单位：%

由表2可以看出,未净化的基质产生基质效应显著,4种化合物ME为68.0%～92.3%,发生了“基质诱导色谱响应减弱现象”[29]。经过净化后ME升高并接近100%,Prime HLB净化后ME为82.8%～120.1%,平均值102.8%,差值37.3%,QuEChERS净化后ME为76.6%～111.9%,平均值94.1%,差值35.3%,HLB净化后ME为102.2%～143.5%,平均值125.0%,差值41.3%。QuEChERS净化后4种化合物ME差值最小,结果集中,平均值94.1%,接近100%。此外,QuEChERS操作步骤简单,容易获得较高回收率和较好重现性,因此本研究采用QuEChERS净化方法。

2.3 线性范围、检出限

本研究在优化气相色谱条件下,能较好地分离样品中的氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈和氟虫腈砜。采用HP-5色谱柱分离,QuEChERS净化,外标法定量。结果表明,氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈和氟虫腈砜分别在线性范围0.005～0.2 μg/mL内,回归方程的相关系数R2均>0.999,线性较好。4种化合物的标准曲线图见图2。

a-氟甲腈;b-氟虫腈亚砜;c-氟虫腈;d-氟虫腈砜图2 四种化合物的标准曲线图Fig.2 Standard curves of four compounds

以氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈和氟虫腈砜呈阴性的鸡蛋为样品在定量限、标准曲线中点和标准曲线最高点进行加标回收实验,即样品加标浓度0.025、0.4、1.0水平下进行加标回收实验,进行准确度和精密度测试,每个水平平行实验6次(n=6),准确度以回收率表示,精密度以相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)表示。

表3 三种加标浓度下氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈和氟虫腈砜的回收率及相对标准偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of fluorocarbonitrile,fipronil sulfoxide,fipronil and fipronil sulfone at the three spiked concentrations

从表3中可知,氟甲腈加标回收率为88.8%～99.3%,RSD在1.22%～4.04%,氟虫腈亚砜加标回收率为96.8%～104.7%,RSD在0.86%～4.71%,氟虫腈加标回收率为91.5%～115.1%,RSD在3.09%～5.22%,氟虫腈砜加标回收率为100.1%～106.1%,RSD在0.93%～2.04%,氟虫腈及其代谢物的总加标回收率为88.8%～115.1%,RSD在0.86%～5.22%。本研究采用的方法其精密度和准确度满足鸡蛋中氟虫腈及代谢物残留检测的要求。

3 结论

本研究通过对3种常见的净化方式进行对比选择后,采用气相色谱法检测,试样经QuEChERS净化,有效降低或消除鸡蛋中蛋白质、脂肪等基质干扰,采用该方法4种氟虫腈及其代谢物的检出限均为0.01 mg/kg,平均回收率为88.8%～115.1%,RSD为0.86%～5.22%。与其他方法相比,该研究具有操作简单、分析速度快、经济成本低等优势,可应用于鸡蛋中氟虫腈的检测分析,并适合广泛推广。