QuEChERS-超高效液相色谱-质谱法测定鲜蛋中氟虫腈及其代谢物

熊 雯 易路遥 晏 亮 程一鑫 杨婷婷 郭春梅 虞雪军 章 红

(江西省药品检验检测研究院，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心, 南昌 330029)

氟虫腈，英文通用名为fipronil，商品名为锐劲特(Regent)，分子式：C12H4Cl2F6N4OS，分子量：437.2，是由原法国罗纳-普朗克公司于1987年开发的苯基吡唑类高效广谱性杀虫剂。

氟虫腈在环境中主要以水解、光解及微生物降解为主，现已发现的代谢产物有9种[1]，其中，氟虫腈砜、氟甲腈、氟虫腈亚砜是目前关注最多的三种代谢物[2-4]。在大鼠、小鼠以及人体内，氟虫腈的主要代谢产物是氟虫腈砜[5]，在植物、土囊代谢中，氟甲腈是最重要的光解产物[6]；在水生态中，通过生物与非生物共同作用，氟虫腈主要降解成氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈砜[7，8]。研究表明，氟虫腈砜作用于γ-氨基丁酸受体，毒性比母体大6倍； 氟甲腈对小鼠及家蝇的毒性与氟虫腈差不多；然而这3种代谢产物都不容易进一步降解 ，因此对环境危害远远大于母体氟虫腈[6,9，10]。

2017年8月，持续发酵的“毒鸡蛋”事件，在45个国家发现了受氟虫腈污染的鸡蛋或蛋品，包括欧盟26国、中国香港、美国、俄罗斯、南非和土耳其等国家或地区。针对蛋中氟虫腈及其代谢物的限量，我国暂未做出规定，GB2763—2016《食品中农药最大残留限量》中仅规定了氟虫腈(以氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜之和计)在24项植物源性食品中残留限量标准，限量在0.02～0.1mg/kg之间[11]；中国香港特别行政区《食物内除害剂残余规例》规定了蛋类氟虫腈(以氟虫腈与氟虫腈砜之和计)最大残留限量为0.02mg/kg[12]；澳大利亚新西兰食品管理局规定蛋类氟虫腈(以氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜之和计)最大残留限量为0.02mg/kg[13]；日本肯定列表中规定蛋类氟虫腈最大残留限量为0.02mg/kg[14]；欧盟规定蛋类氟虫腈(以氟虫腈与氟虫腈砜之和计)最大残留限量为0.005mg/kg[15]。

QuEChERS方法是一种简单、省时、省力、廉价、成本低、试剂用量小、检测范围广、高效的样品前处理技术；液相色谱-串联质谱因其高选择性、高灵敏度成为农药残留分析中最常用的检测技术。目前QuEChERS结合液相色谱-串联质谱法已被国内外农药兽药残留分析机构广泛采纳。本实验采用Querchers方法对鸡蛋、鸭蛋以及鹌鹑蛋进行前处理，运用液相串联质谱三重四级杆的MRM模式检测氟虫腈及其3种代谢物，并采集鸡蛋、鸭蛋以及鹌鹑蛋共159批次样品进行检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-TQS质谱仪，色谱柱-C18(美国Waters)；离心机(美国ThermoFisher)；涡旋混合器(德国IKA)。

氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜标准品购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度均大于98%；氟甲腈购自农业部环境保护科研监测所，含量100mg/L；乙腈、甲醇等有机试剂均为色谱纯(Sigma)；NaCl为分析纯(国药集团)；十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)(岛津公司)

1.2 材料

鸡蛋、鸭蛋以及鹌鹑蛋(市售)

1.3 标准溶液的制备

分别准确称取氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜标准品10mg于100mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解，用乙腈定容至刻度，配制浓度为100 mg/L 的单标储备液，于-20℃条件下储存。氟虫腈及其代谢物标准混合使用液( 5 mg/L) 由乙腈稀释氟虫腈及其代谢物单标储备液制得。分别精密吸取混合标准使用液适量，置10ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度,摇匀得到10，20，50，100，200和500μg/L的系列混合标准工作溶液，于 4 ℃ 条件下储存备用。

1.4 色谱-质谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色谱柱；柱温30℃；进样量:2μL；流动相:A相为水，B相为乙腈。流速：0.4mL/min，梯度洗脱程序见表1。

表1 氟虫腈及其代谢物的洗脱程序

离子源：ESI源；扫描方式：MRM负离子模式；毛细管电压：1500V；干燥气温度500℃，干燥气流速800L/h；锥孔气流速 150L/h；氟虫腈及其代谢物的质谱信息见表2。

表2 氟虫腈及其代谢物的质谱信息

续表2

1.5 样品前处理

称取5g经均浆后的样品，准确加入5mL1%甲酸水溶液，振荡30s，加入3.0g NaCl，涡旋30s，8000r/min离心5min，取1mL上清液，待净化。将1mL上清液转移至2mL净化管中(含PSA 50mg、C1850mg、MgSO4100mg)，涡旋30s，10000r/min 离心1min，取上清液，过0.22μm滤膜，上机分析。

2 结果与讨论

2.1 样品提取溶剂的选择

文献报道[4,16,17]的氟虫腈及其代谢物的提取溶剂一般采用乙腈、酸化乙腈、乙腈水溶液,考虑鲜蛋含水量超过80%，实验仅考察了乙腈、含1%甲酸乙腈以及含5%甲酸乙腈的提取效率，结果发现，纯乙腈对4个化合物的平均提取率仅为79.3%，而酸化乙腈具有较好的提取效果。这可能是由于氟虫腈及其代谢物属于弱碱性化合物，更易溶于酸性溶剂的原因。对比含1%甲酸乙腈与含5%甲酸乙腈，发现两种溶剂提取效果相差无几，各化合物回收率均达83%以上。因此，选用含1%甲酸乙腈作为提取溶剂。

2.2 氯化钠质量的选择

鲜蛋经1%甲酸乙腈振荡提取，得到乙腈水混合提取溶液，加入一定量的氯化钠盐析分层，能使乙腈层更好的沉淀鲜蛋中的蛋白质。实验采用5mL1%甲酸乙腈溶液，3g氯化钠，发现乙腈与水溶液能快速分层，目标物回收率均达到85%以上，且乙腈层较为澄清。

2.3 QuEChERS净化条件的优化

PSA通过氢键和化合物作用，可去除脂肪酸、部分有机酸、糖和色素。C18吸附剂是在硅胶基质上接有十八烷基，对油脂、甾醇和维生素的去除效果显著。结合鲜蛋基质特性以及氟虫腈类化合物的理化性质，本实验采用混合型净化剂结合无水硫酸镁进一步除水，并对PSA、C18和无水硫酸镁用量进行优化，结果表明50mgPSA，50mgC18、100mg无水硫酸镁时目标化合物平均回收率最高，同时各化合物的回收率均到达88%以上，本实验室采用该组合作为最佳QuEChERS净化剂。

2.4 色谱条件的选择和优化

本实验采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色谱柱，考察了甲醇-水与乙腈-水两种流动相，试验发现，使用乙腈-水作为流动相，化合物整体峰型较好；部分文献报道水相溶剂添加甲酸，本实验对比发现水相添加甲酸后，氟虫腈砜、氟虫腈亚砜响应略有抑制，尤其是氟虫腈，其响应值降低更为明显。因此，选用乙腈-水作为流动相。氟虫腈及其代谢物的离子流图见图1。

2.5 方法学验证

2.5.1线性范围与检出限

选用不含待测组分的空白基质样品，分别加入混合标准工作液(10、20、50、100、200和500μg/L)各500μL，涡旋混匀，静置30min后，经1.5节样品前处理，获得基质标准溶液(浓度为1、2、5、10、20和50μg/kg)，绘制标准工作曲线。以峰面积为纵坐标y，浓度为横坐标x，各目标化合物在1～50μg/kg范围内线性关系良好，相关系数(r) 为0.9960～0.9981。在基质空白样品中添加标准溶液，以信噪比 S/N≥3确定方法检出限(LOD)，氟虫腈及其代谢物方法检出限达到0.1～0.2μg/kg，具体结果见表3。

图1 氟虫腈及其代谢物的离子流图

名称基质线性回归方程相关系数r检出限(LOD)氟虫腈溶剂y=10351.4x-286.2190.99880.1鸡蛋y=10167.2x+788.3410.99770.1氟甲腈溶剂y=5984.42x+168.4050.99910.2鸡蛋y=6001.76x-771.7260.99810.2氟虫腈亚砜溶剂y=5263.13x+101.5020.99890.2鸡蛋y=4848.05x+631.8010.99600.2氟虫腈砜溶剂y=10803.5x+783.4630.99830.1鸡蛋y=9908.57x+824.8450.99710.1

2.5.2回收率

以空白样品做添加回收实验，在鸡蛋、鸭蛋以及鹌鹑蛋空白样品中分别添加不同量的混合标准溶液(添加水平分别为5、10、20μg/kg)，每个浓度设置2个平行样，按上述优化的实验方法测定氟虫腈及其3种代谢物的回收率。三类鲜蛋产品中，氟虫腈及其3种代谢物的回收率在88.1%～110.5%之间，结果见表4。

表4 不同基质中各化合物的回收率

续表4

2.6 基质效应评价

液相色谱-串联质谱中的基质效应由分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致，表现为离子增强或抑制作用[18]。实验以基质匹配校准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率考察不同化合物的基质效应，其比值越接近1，则基质效应越小[19]。分别比较纯试剂和鸡蛋、鸭蛋以及鹌鹑蛋三种不同基质配置标准曲线溶液的基质效应。结果表明，在3种鲜蛋基质中，氟虫腈及其3种代谢物的基质效应在85.5%～108.2%之间，基质效应均不明显，结果见表5。

表5 不同基质中各化合物的基质效应

2.7 实际样品的测定

本实验在江西省3个城市抽取了159批次样品进行了氟虫腈及代谢物的监测，包括85批次鸡蛋、43批次鸭蛋、31批次鹌鹑。其中，13批次鸡蛋检出氟虫腈砜，含量在0.00056～0.0012mg/kg之间；14批次鸭蛋检出氟甲腈, 含量在0.00050～0.0011mg/kg之间；7批次鹌鹑蛋检出氟虫腈砜，含量在0.00056～0.0021mg/kg之间。结果表明氟虫腈及其代谢物的检出均远远低于国际限量。

试验同时考察了氟虫腈代谢物在鲜蛋的分布情况，选择含氟虫腈代谢产物的3批鸡蛋、1批鸭蛋进行了蛋黄、蛋清含量的比较实验，结果发现仅蛋黄检出氟虫腈代谢产物，而蛋清未检出该类物质。这这说明氟虫腈代谢物易富集于蛋黄中。

3 结论

建立了针对3种鲜蛋基质中氟虫腈及其3种代谢物的液相-质谱的定量和定性方法，对提取试剂、净化吸附剂条件进行优化，并对基质效应及方法学进行评价，本实验方法将QuEChERS 前处理与质谱检测结合，实现鲜蛋中目标化合物的快速准确定量分析，在合理安排时间的情况下，3小时内可以完成5～6批检品中氟虫腈及其代谢物的准确测定。