miR-185-5p抑制支气管上皮细胞16HBE增殖的作用机制

王海霞，秦绪慧，薛璐

(中南民族大学 生命科学学院 & 医学生物研究所 & 武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074)

肺癌(lung cancer, LC)是一种常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡的原因之一.由于缺乏有效的早期诊断方法和临床治疗，肺癌患者的预后较差[1-2].所以，迫切需要进一步研究肺癌发生发展的相关生化途径和潜在分子机制，寻找新的肺癌治疗靶点和提高临床疗效.miR-185-5p是一种重要的具有抑癌基因性质的微小RNA，它在多种肿瘤组织中的表达量与正常细胞中不同，其通过与靶mRNA的3′非编码区(3′-UTR)互补配对发挥生物学作用，miRNA可能成为肿瘤治疗的新靶点.miR-185-5p在其它癌症如胃癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等也起着抑癌基因的作用.在肺癌中，miR-185-5p担任抑制细胞生长的角色，具体机制尚不明确，有研究结果支持肝癌中miR-185-5p调控抑制PLAC8，并上调了细胞活力[10]；PLAC8(胎盘特异蛋白8) 也称为Onzin，是一个富含半胱氨酸，在进化上高度保守的蛋白，它能影响各种细胞生理过程如增殖凋亡等和控制各种人类疾病，在肿瘤发生发展中起着关键作用[11].在肺腺癌中miR-185-5p也通过与其他靶基因如CDK6、HMGA2和CCNE1等作用来影响细胞生理活性.生物信息学分析发现miR-185-5p与PLAC8基因的3′-UTR区有结合位点.miR-185-5p与PLAC8的相互关系在肺癌中尚未见研究，因此，本文旨在研究miR-185-5p抑制支气管上皮细胞16HBE增殖的调控作用机制.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

miR-185-5p mimics和NC(上海生工)；RMPI基础培养基(美国HyClone)；人支气管上皮细胞株16HBE、人肺腺癌细胞 A549、胎牛血清(上海中乔新舟生物科技)；Lipofectamine 3000、Opti-MEM (上海英潍捷基)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、Beyo ECL Plus、双荧光素酶检测试剂盒(碧云天)；Anti-PLAC8抗体(Cell Signaling Technology)；Anti-β-Actin(康为世纪生物公司)；引物合成(武汉擎科生物).

二氧化碳恒温细胞培养箱(371，Thermo Fisher Scientific)；倒置显微镜(IX81，奥林巴斯)；高速离心机(5424R，EPPENDORF)；PH计(PHS-2F，上海雷磁有限公司)；化学发光凝胶成像系统(Chemnidoc XRS，BIO-RAD)；核酸凝胶成像系统(JS-2012，BIO-RAD)；超净工作台(SW-CJ-1CU，苏州安泰公司)；电泳仪(DYY-6C，北京市六一仪器厂)；7500-Fast 实时荧光定量 PCR 仪(QuantStudio 3，Thermo Fisher Scientific)；超微量分光光度计 (ND-2000，Thermo Fisher Scientific)、酶标仪(infinite M200pro，TECAN).

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染

16HBE和A549细胞均培养在含 10% 胎牛血清的1640完全培养基中，于 37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养.根据生长情况，取对数期的细胞用于后续实验.

取处于对数生长期的16HBE细胞传至6孔板中，将16HBE 细胞培养至70%～80% 融合时，按照Lipofectamine 3000 转染试剂说明书进行转染.分为空白对照组、不同浓度梯度的miR-185-5p mimic组、NC组，转染 48 h 后，收集细胞进行实验，最后选取最佳浓度进行后续实验.

1.2.2 qRT-PCR检测细胞内miR-185-5p和PLAC8mRNA含量

分别取一中皿处于对数生长期生长状态良好的细胞，待细胞长满后，胰酶消化后转移到1.5 mL Ep管中，离心弃废液后，加1 mL Trizol，通过相对荧光定量PCR实验检测分析各细胞内miR-185-5p和PLAC8mRNA的表达量，实验步骤：提取细胞总RNA、反转录获得cDNA、qPCR扩增、数据处理分析.

1.2.3 双荧光素酶活性实验检测 miR-185-5p 对PLAC8的靶向性

采用TargetScan软件预测PLAC8mRNA的3′-UTR区与miR-185-5p结合位点，结果显示(图2a)，miR-185-5p在PLAC8的3′-UTR区有12个碱基的结合位点.将包含PLAC8野生型(WT)的 3′-UTR 的 pmir GLO 质粒和PLAC8突变型(Mut)的 3′-UTR 的 pmir GLO 质粒分别与 miR-185-5p mimic 和 mimic control 转染至16HBE细胞，共分为6组，分别为：pmir GLO组、PLAC83′UTR-WT组、miR-185-5p mimics+PLAC83′UTR-WT组、miR-185-5p NC+PLAC83′UTR-WT组、PLAC83′UTR-Mut组，miR-185-5p+PLAC83′UTR-Mut组，每组各重复 6 个孔，转染后 48 h，利用双荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶活性，同时检测海肾荧光素酶活性作为内参对照.

1.2.4 MTT检测细胞增殖能力

取一中皿处于对数生长期的16HBE细胞，胰酶消化后加1 mL培养基重悬细胞，用血球计数板计数，根据细胞计数，按照2000个/200 μL的细胞浓度进行稀释，按照每孔2000个细胞接种到96孔板，每个时间点mimics、阴性对照及空白对照组均接种6个复孔，共铺5个相同的96孔板；将细胞置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中，培养至细胞融合度达到30%时，用lipofectamine 3000转染试剂分别转染miR-185-5p mimics及miR-185-5p NC序列，每孔miRNA mimics转染量为0、10、20、40、60 pmol；分别在转染0、24、48、72、96 h后进行MTT检测，提前4 h在每孔中直接加20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，继续置于细胞培养箱中孵育4 h，取出96孔板终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加150 μL DMSO，置于酶标仪中振荡5 min，使结晶物充分溶解，选择490 nm波长，用酶标仪测定各孔的光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.

1.2.5 细胞周期的检测

接种在6孔板中的16HBE细胞培养至70%～80% 融合时，转染miR-185-5p 48 h后，PBS 洗2次，胰酶消化后收集在1.5 mL 离心管中，1000 r·min-1、离心5 min，去除上清，加 1 mL PBS 重悬细胞，1000 r·min-1离心5 min，重复一次.弃上清，加入 500 μL 冰上预冷的70%乙醇，重悬细胞，置于冰上孵育 2 h或放置4 ℃过夜；孵育完成后，3000 r·min-1、离心 5 min，去除乙醇；用预冷 PBS 将细胞沉淀重悬后，静置 30 s，3000 r·min-1离心5 min .加入500 μL 事先配置好的 PI 和 RNase 混合液，避光室温孵育 30 min.上机检测，收 20000个细胞，分析数据.

1.2.6 Western blotting检测细胞内蛋白表达水平

分别提取处于对数生长期细胞和转染了不同浓度梯度的miR-185-5p mimics的16HBE细胞的总蛋白，根据目的蛋白分子量大小，用SDS-PAGE凝胶试剂盒快速配制适宜浓度的凝胶，点样后电泳、转膜，配制5%的脱脂奶粉封闭1 h，用TBST洗3次，每次5 min；孵育一抗 (1∶1000稀释)，4 ℃过夜；孵完一抗后用TBST洗3次，每次5 min；再孵育二抗(1∶10000稀释)，室温下孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min；ECL显影，观察结果.

1.2.7 统计学方法

2 结果与分析

2.1 miR-185-5p对16HBE细胞增殖活性的影响

qRT-PCR结果(图1(a))显示：正常人肺支气管上皮细胞16HBE中miR-185-5p的表达水平比肺癌细胞A549中低(P<0.01)；在16HBE细胞中，转染不同浓度的miR-185-5p mimics 0～96 h，检测各组细胞增殖活性(图1(b))，结果显示：转染后24～96 h，与转染NC对照组比较， 16HBE细胞的增殖活性随着miR-185-5p mimics浓度升高明显降低(P<0.05).

与A549细胞组相比，**P<0.01；与NC组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.图1 miR-185-5p对16HBE细胞增殖活性的影响Fig.1 Effect of miR-185-5p on proliferation activity of 16HBE(a)人肺支气管上皮细胞和肺癌细胞中miR-185-5p相对含量检测结果，U6为内参；(b)MTT法检测miR-185-5p对16HBE细胞增殖的影响

2.2 miR-185-5p对16HBE细胞内PLAC8的mRNA及蛋白含量的影响

生物信息学预测结果显示，miR-185-5p在PLAC8基因3′-UTR区存在12个碱基的结合位点(图2(a)). Western blotting结果(图2(b)、图2(c))显示：正常人肺支气管上皮细胞中PLAC8表达水平较肺癌细胞中高(P<0.05)，且16HBE中miR-185-5p的表达水平比A549中低(图1(a)).16HBE细胞转染不同浓度梯度的miR-185-5p mimics(转染量以6孔板的1个孔为单位) 48 h后，qRT-PCR结果(图2(d))显示：与转染NC对照组比较，细胞内PLAC8mRNA含量明显降低(P<0.05)；同时 Western blotting结果(图2(e)、图2(f))显示，随着转染的miR-185-5p mimics浓度升高，细胞内PLAC8蛋白表达也逐渐下降(P<0.05)，选用700 pmol浓度的miR-185-5p mimics进行后续实验.以上数据和结果说明：miR-185-5p与PLAC8基因之间可能存在相互作用关系，具体机制有待进一步研究.

与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01.图2 miR-185-5p对16HBE细胞内PLAC8的mRNA及蛋白表达量的影响Fig.2 Effect of miR-185-5p on the mRNA and protein expression of PLAC8 in 16HBE(a)miR-185-5p与PLAC8基因3′-UTR区结合位点的生物信息分析；(b)肺癌细胞和人肺支气管上皮细胞中PLAC8蛋白表达量检测结果；(c)肺癌细胞和人肺支气管上皮细胞中PLAC8蛋白相对定量结果；(d)16HBE细胞转染不同浓度的miR-185-5p mimics后48 h，各组细胞内PLAC8的mRNA含量检测结果；(e)16HBE细胞转染miR-185-5p mimics后48 h，各组细胞内PLAC8蛋白含量检测结果；(f)16HBE细胞转染miR-185-5p mimics后48 h，各组细胞内PLAC8蛋白相对定量结果

2.3 miR-185-5p 对 PLAC8 的靶向性

TargetScan软件预测的结果表明，PLAC8为miR-185-5p的潜在靶基因.双荧光素酶报告分析检测16HBE细胞中miR-185-5p对PLAC8的靶向性，实验结果(图3)表明：与PLAC83′UTR-WT组相比，转染野生型PLAC83′UTR-WT质粒和miR-185-5p mimic 可明显抑制相对荧光素酶活性(P<0.05)，与miR-185-5p预测靶基因PLAC8结果相符(图2(a))，PLAC8为miR-185-5p调控的一个靶基因，且与PLAC83′UTR区结合调控.

与PLAC8 3′UTR-WT组相比，***P<0.001.图3 双荧光素酶实验检测miR-185-5p对PLAC8的靶向性Fig.3 Dual luciferase assay was used to detect the targetingof miR-185-5p to PLAC8

2.4 miR-185-5p对细胞周期的影响

16HBE细胞转染700 pmol miR-185-5p mimics 48 h后，收集细胞、PI染色后进行上机检测细胞周期变化，结果显示(图4(a)、图4(b))，与16HBE空白组和NC组相比，转染miR-185-5p mimics组G1期细胞数减少，S期细胞数显著上升，说明miR-185-5p能改变16HBE细胞周期的分布，将细胞周期阻滞在S期，这可能是使细胞增殖降低(图1(b))的原因.

为了进一步了解miR-185-5p影响周期改变的具体作用机制，利用 Western blotting检测mimics组细胞中的与细胞周期相关的蛋白的表达量. 结果显示(图5(a)、图5(b))：与空白组和NC组相比，miR-185-5p mimics组细胞内c-Myc、CDK2、CyclinA2、P21、p-Cdc2蛋白的表达量相对较低，说明miR-185-5p可能直接或间接作用于周期蛋白或细胞增殖相关蛋白，从而改变了细胞周期的分布.

与16HBE组和NC组相比，**P<0.01，***P<0.001.图4 miR-185-5p对16HBE细胞周期的影响Fig.4 Effect of miR-185-5p on the cell cycle of 16HBE(a)miR-185-5p使细胞周期阻滞在S期；(b)细胞周期统计图显示miR-185-5p使S期的细胞数目明显增加

与16HBE组和NC组相比，*P<0.05，**P<0.01.图5 miR-185-5p对16HBE细胞周期蛋白的影响Fig.5 Effect of miR-185-5p on the cyclins of 16HBE(a)Western blotting 检测miR-185-5p对细胞周期蛋白的影响；(b)周期蛋白相对定量结果

3 讨论

microRNAs (miRNAs)是一种小的内源性的非编码RNA，在物种间高度保守[12].miRNA通过结合靶mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)，降解或抑制靶mRNA的翻译来控制基因表达，据估计，多达60%的基因可能受到迄今为止鉴定的1900多种人类miRNA的调控.miR-185-5p参与许多病理过程，尤其是在癌症中.然而，miR-185-5p/靶网络非常复杂，在不同的肿瘤疾病中有着不同的靶基因和调控机制.

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，目前，尽管靶向治疗的快速发展，化疗药物仍广泛用于肺癌治疗，然而，其效力通常受到获得性耐药性的影响.miR-185-5p在耐药性中起重要作用，PEI等发现miR-185-5p抑制A549细胞增殖，增加A549细胞对顺铂的敏感性及凋亡相关因子的表达；miR-185-5p的下调可能通过抑制ABCC1(ATP-binding cassette, subfamily C, member 1)参与非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)细胞对顺铂的耐药，促进细胞生长，降低凋亡相关因子水平，说明抑制miR-185-5p参与肺癌的化疗耐药，miR-185-5p联合顺铂治疗可能是逆转化疗耐药的一种方法.TAKAHASHI等也证明了miR-185-5p可以抑制H1299和A549细胞增殖[7].最近的一项研究表明敲除转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)可能通过上调miR-185-5p，降低小鼠双微体4蛋白(MDM4)在NSCLC中的表达，从而抑制NSCLC的生长和转移，促进细胞凋亡[19].Circle RNA FOXP1通过调控miR-185-5p/Wnt1信号通路促进肺癌细胞A549和H1299增殖.FOXD2-AS1抑制A549和H1299细胞中miR185-5p与其靶基因SIX1的结合[21].这些研究为NSCLC的治疗提供了新的潜在的治疗靶点.在肺腺癌中miR-185-5p也通过与其它靶基因如CDK6、HMGA2和CCNE1等作用影响细胞生理活性.本文发现miR-185-5p可能也通过调控抑制PLAC8基因抑制细胞增殖.

本文研究结果显示：随着转染的miR-185-5p模拟物的浓度升高，可以明显抑制16HBE细胞的增殖活性.通过生物信息学和双荧光素酶活性实验结果得出miR-185-5p与PLAC8基因3′-UTR区结合后抑制其表达，miR-185-5p在肺癌细胞中的高表达导致细胞内PLAC8蛋白的表达显著降低.miR-185-5p使细胞周期阻滞在S期，且抑制了细胞内周期蛋白和细胞增殖相关蛋白c-Myc、CDK2、CyclinA2、P21、p-Cdc2蛋白的表达.这些数据说明：在肺癌中miR-185-5p作为抑癌基因，可能直接或间接作用于PLAC8基因、周期蛋白和细胞增殖相关蛋白的表达来改变细胞周期的分布，抑制细胞增殖活性，为肺癌的治疗提供潜在的基因治疗靶点.