蒿秦化斑方对紫外线损伤角质形成细胞黏附分子及PI3K/AKTAKT/GSK-3β通路的影响

王思艺 孙丽蕴

摘要 目的：觀察蒿秦化斑方对HaCat细胞紫外线B（UVB）急性损伤模型细胞黏附分子及PI3K/AKT/GSK-3β通路的影响，探讨该方治疗光敏感性皮肤病的作用机制。方法：采用300 mJ/cm2 UVB建立HaCat细胞急性光损伤模型，使用不同剂量蒿秦化斑方干预，分为空白对照组、UVB模型组、及蒿秦化斑方高、中、低剂量组。采用RT-PCR法检测细胞黏附分子ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1相对表达量，采用蛋白质免疫印迹法分析PI3K/AKT/GSK-3β通路相关节点p-AKT（Ser-473）、p-AKT（Thr-308）、GSK-3β、PI3K相对表达量。结果：UVB急性光损伤可有效减少HaCat细胞ICAM-1的表达（P<0.01），对VCAM-1及ELAM-1表达影响不显著;蒿秦化斑方高剂量组能有效抑制HaCat细胞3种细胞黏附分子的表达（P<0.05）;蒿秦化斑方中剂量组能有效抑制HaCat细胞内皮细胞白细胞黏附分子-1（ELAM-1）及血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达（P<0.01）。UVB急性光损伤对HaCat细胞AKT磷酸化、PI3K表达影响不显著，蒿秦化斑方低剂量处理对HaCat细胞AKT磷酸化具有促进作用（P<0.05）。UVB急性光损伤使HaCat细胞糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表达水平升高（P<0.01），蒿秦化斑方高、中、低剂量处理均对HaCat细胞GSK-3β表达水平有所抑制（P<0.01）。结论：蒿秦化斑方能降低由UVB急性损伤造成的HaCat细胞ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1等黏附分子的表达进而缓解局部炎症和迟发型超敏反应的发生，并且能够激活HaCat细胞PI3K/AKT/GSK-3β通路，在UVB造成的急性光损伤中起到抗氧化、抗凋亡和降低炎症反应的作用。

关键词 光敏感性皮肤病;蒿秦化斑方;蛋白激酶B;糖原合成酶激酶-3β;细胞黏附分子;人永生化角质形成细胞;紫外线B;紫外线损伤

Abstract Objective：To observe the effects of Haoqin-Huaban on the relative adhesion factors and the PI3K/AKT/GSK-3β pathway of an acute UVB light HaCat-cell injury model in order to further explore the mechanism of the treatment for photosensitive skin disorders.Methods：UVB light（300 mJ/cm2） was used to establish an acute light HaCat-cell injury model.The intervention was performed by using Haoqin-Huaban in various concentrations.The groups were divided into：a blank control group（C）; an UVB model group（M）; a high Haoqin-Huaban dosage group（G）; medium Haoqin-Huaban dosage group（Z）; low Haoqin-Huaban dosage group（D）.Real-time PCR was conducted to detect the relative expressions of 3 cell adhesion molecules（CAMs），i.e.，ICAM-1，ELAM-1 and VCAM-1.Western Blotting was implemented to analyze the relative expressions of p-AKT（Ser-473），p-AKT（Thr-308），GSK-3β，and PI3K，which were all related nodes of the PI3K/AKT/GSK-3β pathway.Western Blot method was used to analyze the relative expression of p-AKT（Ser-473），p-AKT（Thr-308），GSK-3β and PI3K related nodes in the PI3K/AKT/GSK-3β pathway.Results：UVB acute light injury reduced ICAM-1 expression in the HaCat cell model and had no significant effect on the expressions of VCAM-1 and ELAM-1（P<0.01）.The expressions of the three CAMs in the HaCat cell model were effectively inhibited in the G group（P<0.05），while those of ELAM-1 and VCAM-1 were considerably impeded in the Z group（P<0.01）.It was also found that acute UVB light injury had no significant effect on AKT phosphorylation and PI3K expression in the HaCat cell model.The low-concentration treatment of Haoqin Huaban Forumla can promote the phosphorylation of AKT in HaCat cells（P<0.05）.Acute UVB light damage increased the GSK-3β expression level of HaCat cells（P<0.01）.The high，medium and low concentration treatments of Haoqin Huaban Formula inhibited the GSK-3β expression level of HaCat cells（P<0.01）.Conclusion：Haoqin-Huaban Formula can reduce the expression of adhesion molecules such as ICAM-1，ELAM-1 and VCAM-1 in HaCat cells caused by acute UVB damage，thereby alleviating the occurrence of local inflammation and delayed-type hypersensitivity，and can activate HaCat cells PI3K/AKT/GSK-3β pathway and plays a role in anti-oxidation，anti-apoptosis and reducing inflammation in the acute light damage caused by UVB.

Keywords Photosensitive skin disease; Haoqin-Huaban Formula; AKT; GSK-3β; Cell adhesion molecule; HaCat cells; Ultraviolet B; Ultraviolet injury

中图分类号：R289.5;R275.9文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.012

光敏感性皮肤病是由紫外线照射造成皮肤多种病理反应的一系列疾病，其包括急性光损伤、慢性光老化、光变态反应（如多形性日光疹）等，甚至能够诱发皮肤肿瘤，其临床表现通常以日光暴露部位出现红斑、水肿及多形性皮损，患者自觉灼热瘙痒为主[1]。蒿秦化斑方，是在皮外科名老中医赵炳南“光毒郁肤”理论基础下创立而来，以“清热、解毒、凉血”为法，在治疗光敏感性皮肤病方面具有较好疗效。研究发现，蒿秦化斑方具有增强细胞活性、抗氧化、调节炎症介质表达的作用。光敏感性皮肤病在临床中的主要表现为组织学上的炎症和表皮细胞的病理变化，皮肤的炎症性损害往往依赖于各种细胞的相互作用，有研究显示紫外线造成的皮肤局部超敏反应可能与细胞黏附分子的表达相关，细胞黏附分子的表达能够诱导皮肤炎症介质的产生和免疫细胞的浸润，从而产生局部炎症和皮肤湿疹样改变[2]。除此之外，既往研究显示PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活具有抑制氧化应激、促进增殖、抗凋亡、抑制炎症反应等作用[3-4]，这与紫外线辐射诱发的光敏感性皮肤病的发病机制较为一致。本研究以人永生化角质形成细胞（Human Skin Keratinocytes，HaCat）为研究对象，探索蒿秦化斑方缓解紫外线B（Ultraviolet B，UVB）损伤的潜在机制，以证明蒿秦化斑方保护HaCat细胞免受UVB辐射损伤的功效。探究了HaCat细胞相关黏附分子，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、内皮细胞白细胞黏附分子-1（ELAM-1），以及PI3K/AKT/GSK-3β通路相关靶点，肌酸肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的影响，进一步探讨该方治疗光敏感性皮肤病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与培养 HaCat细胞由中国中医科学院（编号：3111C0001CCC000373）提供，HaCat细胞在1460培养基中加入10%牛胎血清，在37 ℃，5%二氧化碳剂量的湿化培养箱中培养，直至细胞密度大于80%，以胰酶（0.25%）消化后进行后续试验。

1.1.2 药物 蒿秦化斑方组方与剂量均按照《中华人民共和国药典》（2015年版）规定执行，方剂组成：青蒿30 g、龙胆草10 g、水牛角15 g、生地黄15 g、牡丹皮15 g、赤芍15 g、防风15 g、生甘草6 g。实验药物由北京中医医院饮片药房提供（盛世隆药业有限公司）提供。参照前期课题实验方法制备实验用药液[5]，高剂量中药为最大无毒剂量C（C=12.1 mg/L）、中剂量中药为2/C、低剂量中药为4/C。

1.1.3 主要试剂与仪器 RIPA总蛋白提取试剂盒（Sigma，美国，货号：R0278）;BCA蛋白定量试剂盒（Sigma，美国，货号：BCA1）;NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit（Thermo，美国，货号：NP0050）;NuPAGE Transfer Buffer（20X）（Thermo，美国，货号：NP0061）;TRNzol总RNA提取试剂（天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP405-02）;PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本，货号：RR047B）;SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ ROX plus（TaKaRa，日本，货号：RR82LR）;DL2，000 DNA Marker（TaKaRa，日本，货号：3427Q）。

二氧化碳培养箱（SANYO，日本，型号：MCO-15AC）;分光光度计（Therno scientific，美国，型号：NANODROP 2000）;酶标仪（Therno scientific，美国，型号：MultiSkan3）;电泳仪（Therno scientific，美国，型号：Mini Ge Tank）;转膜仪（Therno scientific，美国，型号：Mini Blot Module）;凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，型号：Tanon 1600）;荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，美国，型号：ABI7500）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理 将上述细胞随机分为空白对照组、模型组、蒿秦化斑方高、中、低剂量组5组，空白对照组不进行任何处理。其余各组置于UVB灯下给予单次剂量300 mJ/cm2的UVB辐射，UVB光照使用UV236照射系统（Waldmann Medizintechnik，Villingen-Schwenningen，德国）进行照射，使用经过校准的光度计（Waldmann）计量照射强度。UVB照射15 min后蒿秦化斑方高、中、低剂量组分别加入12.1 mg/mL（C）、6.05 mg/mL（2/C）、3.25 mg/mL（4/C）劑量中药，作用24 h。

1.2.2 RT-PCR检测 根据产品说明，使用TRNzol总RNA提取试剂盒对各组细胞进行总RNA提取，使用NanoDrop ND-2000进行RNA纯度鉴定，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行反转录，然后按说明进行Real Time-PCR检测，每组进行3孔重复，以测量RNA表达。用2-△△Ct方法计算RNA水平，并标准化为GAPDH，实验使用引物序列。见表1。

1.2.3 蛋白质免疫印迹法分析 使用补充有蛋白酶抑制剂的细胞RIPA裂解缓冲液提取细胞中的蛋白质。使用Bradford方法，用BCA蛋白定量试剂盒测量蛋白质表达水平。通过电泳分离总蛋白质，然后转移到NC膜上，将NC膜用5%脱脂奶粉-TBS在37 ℃下封闭半小时，然后在4 ℃下与一抗孵育过夜。一抗包括：抗PI3K抗体（1∶1 000），抗p-AKT抗体（308）（1∶1 000），抗p-AKT抗体（473）（1∶2 000），抗mTOR抗体（1∶500）GSK-3β抗体（1∶1 000）。温育后，每次用TBST冲洗NC膜5次，每次约3 min，以除去过量的单克隆溶液.然后用二抗孵育，用5%脱脂奶粉-TBS稀释二抗，山羊抗兔IgG（H+L），HRP（1∶20 000），孵育40 min。内参蛋白组以Stripping Buffer、去离子水、TBST洗膜，将NC膜用5%脱脂奶粉-TBS在37 ℃下封闭半小时，加GAPDH鼠单抗（1∶10 000），温育40 min;用5%脱脂奶粉-TBS稀释二抗，山羊抗鼠IgG（H+L），HRP（1∶10 000），孵育40 min。之后进行TBST洗膜并与ECL反应，并对进行胶片曝光显影，2 min后定影，对影像进行相对灰度分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，其中计量资料以均数±标准差（±s）表示，3组及以上组间差异采用单因素方差分析以及Tukey检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞黏附分子相对表达水平 在HaCat细胞UVB急性光损伤实验中，与空白组比较，经UVB照射处理与中药高剂量组处理的HaCat细胞ICAM-1相对表达量显著降低（P<0.01），中、低剂量蒿秦化斑方处理的HaCat细胞ICAM-1表达量较模型组有所回升（P<0.01）;高、中剂量蒿秦化斑方处理的HaCat细胞ELAM-1与VCAM-1表达量均显著降低（P<0.05）。见表2。

2.2 各组PI3K/AKT/GSK-3β通路标志物相对表达水平 在HaCat细胞UVB急性光损伤实验中，与空白组比较，经UVB照射处理的HaCat细胞p-AKT（Thr-308）表达显著降低（P<0.01），GSK-3β表达显著增高（P<0.01）;与模型组比较低剂量蒿秦化斑方处理的HaCat细胞p-AKT（Thr-308）表达量有所回升（P<0.05），与模型组比较高、中、低剂量蒿秦化斑方处理的HaCat细胞GSK-3β表达量有所下降（P<0.01）;此外与模型组比较中剂量蒿秦化斑方处理的HaCat细胞PI3K表达量有所下降（P<0.01）。见表3。

3 讨论

蒿秦化斑方是在皮科知名专家赵炳南教授验方的基础上逐渐完善而成，以“光毒郁肤”为理论基础，以清热凉血解毒为主要原则。方中以青蒿为君药，青蒿善解常夏之暑热，清中有透散之力，可引邪外出，宣化湿热，使血分伏热外透而出。方中水牛角、生地黄、秦艽共为臣药，水牛角咸寒，清热解毒，专入血分，平热降火;生地黄味甘苦寒，协水牛角行清热凉血化斑、滋阴生津之效，秦艽能驱一身之风，祛风除湿，清热利尿，利湿与泄热并进，瘀热得去，湿浊自退。方中牡丹皮、赤芍、防风为佐药，共担清热凉血，活血散瘀，化斑之功效，牡丹皮味苦性辛微寒入心、肝肾经，善清血中伏热，且活血散瘀之力亦佳，赤芍清热凉血、散瘀消肿，能使血流畅而不流瘀，防风祛风解表止痒，牡丹皮治风热在肤瘙痒剧烈者。此外在现代药理学的研究中蒿秦化斑方中药味也多有抗氧化、抗炎、调节免疫的作用，青蒿主要有效成分为青蒿素，相关衍生物为青蒿琥酯等，研究显示，青蒿及其衍生物具有抑制IL-6、IL-10、TNF-α等炎症介质表达，对T细胞相关皮肤超敏反应具有一定的抑制作用[6]。生地黄有效成分梓醇能够抑制细胞黏附分子的表达，并且可以抑制核因子κB以及IL-β、IL-6、TNF-α等炎症介质的表达[7]。牡丹皮中有效成分丹皮酚具有较好的抗氧化能力，同时能够抑制炎症介质表达，并具有抗细胞凋亡的作用[8-9]。赤芍的有效成分中包含较多黄酮类及苷类化合物，可减少细胞氧化物质的产生，并且能够降低细胞炎症介质如TNF-α和IL-6的水平[10-11]。防风的色原酮、多糖及挥发油均有较强的抗氧化作用，且能通过核因子κB信号通路、MAPK信号通路发挥抗炎作用[12-13]。有实验证明甘草提取物甘草酸能够通过抑制炎症介质的表达和抗氧化从而减缓HaCat细胞光老化效应，并且能够抑制凋亡执行蛋白的表达以达到抑制细胞凋亡的作用[14]。

前期研究发现，蒿秦化斑方能够抑制细胞凋亡增加细胞增殖活性，并且能够增加SOD、CAT的表达，减少MDA的表达从而抑制UVB诱导的HaCat细胞氧化损伤，并且可以降低HaCat细胞中IL-10的表达提高TGF-β的表达抑制UVB诱导的HaCat细胞炎症反应，可以初步推测蒿秦化斑方具有抑制氧化应激，下调炎症介质的表达，修复细胞屏障功能[5]。

细胞黏附分子是一类调节细胞与细胞外基质相互结合且起黏附作用的膜表面糖蛋白[15-17]，广泛参与炎症免疫反应，在皮肤科领域，細胞黏附分子与银屑病、特应性皮炎、慢性荨麻疹、红斑狼疮均有较为密切的病理关系，细胞黏附分子的高表达常在一些炎症性皮肤疾病、迟发型超敏反应，感染性皮肤疾病中出现，在这些疾病过程中细胞黏附分子可促进趋化因子和炎症介质的释放，增强免疫细胞的黏附作用，促进免疫细胞向炎症部位浸润，从而促进炎症的发生与发展。在光敏感性皮肤疾病中，已有研究证明多形日光疹发病可能与细胞黏附分子介导的免疫反应有关，紫外线诱导多形日光疹皮损与细胞黏附分子ELAM-1、ICAM-1、VCAM-1的表达密切相关，VCAM-1和ELAM-1促进免疫细胞在内皮细胞上的黏附，多形日光疹的局部炎症反应时效应T细胞通过表达相关细胞因子或受体配相互体作用使细胞黏附分子表达于内皮细胞上，从而促使具有互补表面受体结构的白细胞向局部炎症部位浸润，其黏附分子诱导局部炎症的方式与皮肤迟发型超敏反应类似[18]。多形日光疹患者皮损部位细胞黏附分子及抗原提呈细胞表面表达力提高，黏附分子是参与多形日光疹发病机制的一类重要分子[19]。在本实验中通过UVB照射建立HaCat急性光损伤模型，结果显示与紫外线诱导的迟发性超敏反应不同，在HaCat急性光损伤的情况下对细胞黏附分子的表达影响较小，只有ICAM-1的表达有所减低，结合团队前期试验结果考虑，这可能与急性光损伤所引起的细胞凋亡有关，但通过与空白组对比蒿秦化斑方高剂量组能够有效降低ICAM-1、ELAM-1及VCAM-1 3种细胞黏附分子的表达;蒿秦化斑方中剂量组能够较为有效地抑制ELAM-1以及VCAM-1的表达，可见蒿秦化斑方对HaCat细胞UVB急性光损伤模型ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1相关炎症反应具有一定的调节作用，可以推测蒿秦化斑方可能通过降低HaCat细胞黏附分子的表达，进而减少相关炎症介质表达和嗜酸性粒细胞等其他免疫细胞的浸润，从而具有一定抑制局部皮肤炎症的作用，且更可能对紫外线诱发的迟发型超敏反应具有干预效果。

GSK-3β参与多种信号通路的调控，包括代谢、分化和免疫，以及细胞的凋亡和成活[20]。GSK-3β在底物识别和激酶活性调节方面具有独特的特点，其具有大量的磷酸化靶点，因此其广泛的参与到多种细胞生物过程的调控当中。如GSK-3β活性受PI3K/AKT信号的抑制，相反当PI3K/AKT通路失活时，GSK-3β表现出促凋亡的作用，而当PI3K在质膜上被募集，其经过相关细胞膜脂质的相关磷酸化后促进了AKT的募集以及磷酸化，AKT在氨基酸残基T308和S473上的磷酸化激活后，会在其N端磷酸化GSK-3β，这导致GSK-3β的失活，有研究显示PI3K/AKT通路的激活可使GSK-3β的活性降低40%～50%，进而与Bcl-2等抗凋亡蛋白协同体现抗细胞凋亡的作用。除此之外GSK-3β还是免疫系统许多组分的调节要素[21]，GSK-3β对于TLR的激活在细胞炎症介质的产生中至关重要，研究显示抑制GSK-3β的活性能够有效抑制细胞炎症介质如IL-6、IL-8、TNF的表达，并且能够抑制Wnt信号转导以降低免疫细胞的募集作用，同时抑制GSK-3β还能够还可以提高Treg的表达以及成活以抑制炎症的发生。另研究指出激活PI3K/AKT/GSK-3β通路提高磷酸化GSK-3β的水平，可以通过抑制细胞NOX和iNOS的表达而表现出抗氧化活性[3]。在本实验中，UVB处理对HaCat细胞AKT Thr-308位点磷酸化具有一定的抑制作用，蒿秦化斑方低剂量处理对HaCat细胞AKT Thr-308位点磷酸化具有促进作用，HaCat细胞GSK-3β表达会因UVB辐射而增加，蒿秦化斑方处理对HaCat细胞GSK-3β表达水平有所抑制，这可能与蒿秦化斑方促进PI3K、AKT的磷酸化相关，可见蒿秦化斑方对UVB辐射损伤HaCat细胞PI3K/AKT/GSK-3β通路具有一定调节作用，这与我们在前期研究中得到其能够抗凋亡、抗氧化、降低炎症水平的结果一致，可以推测蒿秦化斑方的药理作用途径很有可能与PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活有关。

总之，蒿秦化斑方能够以降低由UVB辐射急性损伤造成的HaCat细胞ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1等黏附分子的表达进而缓解局部炎症和迟发型超敏反应的发生，并且能够激活HaCat细胞PI3K/AKT/GSK-3β通路，在UVB造成的细胞损伤中起到抗氧化、抗凋亡和降低炎症反应的作用。

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（2020-11-27收稿 责任编辑：张雄杰）