UPLC-Q-TOF-MS联用研究不同厂家前列癃闭通片指纹图谱

崔 璐，褚 征，康廷国，赵庆春，康 烨*

UPLC-Q-TOF-MS联用研究不同厂家前列癃闭通片指纹图谱

崔 璐1，褚 征1，康廷国2，赵庆春1，康 烨1*

1. 北部战区总医院，辽宁 沈阳 110023 2. 辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600

通过建立前列癃闭通片（Qianlielong Bitong Tablets，QBT）的UPLC指纹图谱，考察了9个厂家58批次QBT的质量，为完善该制剂的质量控制奠定基础。采用UPLC法，色谱柱Eclipse Plus C18RRHD（50 mm×2.1 mm，1.8 µm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，采用全时段多波长融合技术，体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃。建立QBT的指纹图谱，并对各样品的指纹图谱进行相似度评价，结合聚类分析评价58批样品的质量，指认了指纹图谱中主要共有峰的化学成分并确定了其药材归属。首次建立QBT的UPLC指纹图谱，对其中16个共有峰进行了化学成分鉴定，分别是辛弗林（1号峰）、虎杖苷（2号峰）、金丝桃苷（3号峰）、新圣草苷（4号峰）、柚皮苷（5号峰）、橙皮苷（6号峰）、新橙皮苷（7号峰）、枸橘苷（8号峰）、朝藿定A（9号峰）、朝藿定B（10号峰）、朝藿定C（11号峰）、淫羊藿苷（12号峰）、芒柄花素（13号峰）、宝藿苷（14号峰）、大黄素（15号峰）、大黄素甲醚（16号峰），确定了16个特征峰来源于方中4味中药，峰1、4～8归属枳壳药材，峰2、3、15、16归属虎杖药材，峰9～12、14归属淫羊藿药材，峰13归属黄芪药材。对9个生产企业58批次样品进行相似度评价，相似度分布在0.600～0.912，通过聚类分析大致可聚为4类。建立QBT的指纹图谱，该方法简便、可靠，为进一步评价和监测QBT的质量提供参考。

UPLC-Q-TOF-MS；前列癃闭通片；质量评价；指纹图谱；相似度；聚类分析；全时段多波长融合技术；辛弗林；虎杖苷；金丝桃苷；新圣草苷；柚皮苷；橙皮苷；枸橘苷；朝藿定；淫羊藿苷；芒柄花素；宝藿苷；大黄素；枳壳；虎杖；淫羊藿；黄芪

前列癃闭通片（Qianlielong Bitong Tablets，QBT）收载于《国家中成药标准汇编》内科肾系分册，是在复方前列癃闭胶囊的基础上改剂型而成的现代中药制剂。本方以黄芪为君药，桂枝、土鳖虫、冬葵果、桃仁、淫羊藿为臣药，柴胡、茯苓、枳壳、虎杖、川牛膝为佐药，共11味药材经水煎煮、浓缩等工艺精制而成，具有益气温阳、活血利水的功效，临床用于治疗肾虚血瘀所致的癃闭，症见尿频、排尿延缓、费力、尿后余沥、腰膝酸软，亦可用于具有上述症候的慢性前列腺炎[1-2]和良性前列腺增生[3-4]的患者。

目前全国有11家生产企业生产QBT，生产企业较多且无统一标准，虽各生产企业的处方以及生产工艺相同，但是各生产企业的药品质量有较大差别，可能是受到原料药来源、生产工艺参数等众多因素影响。为了评价该药质量的一致性，并最大限度地表征QBT的特征成分，本实验以抽检的9个生产企业共58批不同批号的QBT为对象，首次建立其UPLC指纹图谱，并对指纹图谱中的主要特征峰进行化学成分的指认，以及组方中药来源的初步确定。通过计算相似度和聚类分析，对各生产企业各批次样品进行质量评价，为完善QBT的质量控制奠定基础，保证该药的临床疗效。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪、二极管阵列检测器（DAD）、Agilent 6550精确质量四极杆飞行时间（Q-TOF）LC/MS系统，美国安捷伦公司；HS6150型超声波清洗器，天津恒奥科技发展有限公司；Milli-Q超纯水处理装置，美国Millipore公司；Sartorius CP225D型电子分析天平，北京赛多利斯天平有限公司；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 试药与试剂

对照品辛弗林（批号110727-201107）、虎杖苷（批号111575-200502）、金丝桃苷（批号111521-201406）、柚皮苷（批号110722-201312）、橙皮苷（批号110721-201316）、新橙皮苷（批号111857-201102）、朝藿定C（批号111780-201302）、淫羊藿苷（批号110737-200415）、芒柄花素（批号111703-200603）、宝藿苷（批号111852-201102）、大黄素（批号110756-200110）、大黄素甲醚（批号110758-201013）均购自中国食品药品检定研究院，质量分数均≥98%；对照品朝藿定A（批号GZDD-0477）、朝藿定B（批号GZDD-0478）均购自贵州迪大生物科技有限责任公司，质量分数均≥98%；对照品新圣草苷（批号A0032）购于成都曼斯特生物有限公司，质量分数≥98%；对照品枸橘苷（批号p114052）购于Aladdin-阿拉丁试剂（上海）有限公司，质量分数≥98%。

药材黄芪为豆科黄芪属植物蒙古黄芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根（批号120974-201311）、虎杖为蓼科虎杖属植物虎杖Sieb. et Zucc.的干燥根茎和根（批号120980-201005）、桃仁为蔷薇科桃属植物桃(L.) Batsch的干燥成熟种子（批号120953-201106）、川牛膝为苋科杯苋属植物川牛膝Kuan的干燥根（批号121065-201105）、枳壳为芸香科植物酸橙L.的干燥未成熟果实（批号120981-201104）、桂枝为樟科樟属植物肉桂Presl的干燥嫩枝（批号121191- 201304）、茯苓为多孔菌科茯苓属真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核（批号121117- 201308）、柴胡为伞形科柴胡属植物柴胡DC.的干燥根（批号120992-201108）、淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿Maxim.的干燥叶（批号121632-201101）、土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖Walker的雌虫干燥体（批号121533-200702），均购自中国食品药品检定研究院；冬葵果采摘于本溪怀仁县，为锦葵科甜菜属植物冬葵L. 的干燥成熟果实；以上药材均由辽宁省检验检测认证中心中药室王维宁主任中药师鉴定。

供试品覆盖全国26个省共9个生产企业的58批QBT，分别是吉林百琦药业有限公司（BQ）、长春新安药业有限公司（CC）、吉林吉尔吉药业有限公司（JEJ）、沈阳神龙药业有限公司（SL）、陕西华西制药有限公司（SX）、武汉健民药业集团股份有限公司（WH）、江苏万高药业有限公司（WG）、药圣堂（湖南）制药有限公司（YST）、江苏颐海药业有限公司（YH），见表1。

表1 QBT样品的信息

乙腈，质谱级，德国默克集团；甲醇，色谱级，Fisher公司；甲酸，质谱级，赛默飞世尔公司；娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取QBT 20片，除去薄膜衣，称定质量，研细，取0.5 g，精密称定，精密加入50%甲醇溶液25 mL，称定质量，超声处理（功率300 W、频率50 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇溶液补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 取辛弗林、金丝桃苷、虎杖苷、新圣草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、芒柄花素、宝藿苷、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，加50%甲醇溶液1 mL，超声10 min，滤过，即得混合对照品溶液。

2.1.3 各药材供试溶液的制备 取黄芪、土鳖虫、冬葵果、虎杖、枳壳、柴胡、川牛膝、桂枝、淫羊藿、桃仁、茯苓药材粉末，分别按照其在处方中的投料量折算后取样，按“2.1.1”项下方法制备，作为各原料药材对照溶液。

2.2 UPLC色谱条件

色谱柱为Eclipse Plus C18RRHD（50 mm×2.1 mm，1.8 µm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，2%乙腈；5～9 min，2%～10%乙腈；9～12 min，10%～15%乙腈；12～19 min，15%乙腈；19～30 min，15%～26%乙腈；30～36 min，26%～36%乙腈；36～43 min，36%～50%乙腈；43～48 min，50%～80%乙腈；48～49 min，80%～95%乙腈；49～51 min，95%乙腈；检测波长248、270、283、290、306 nm，体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量3.5 µL。理论板数按淫羊藿苷色谱峰计算应不低于1500。

2.3 MS分析条件

2.3.1 一级质谱条件 电喷雾离子源，采用正离子模式检测，干燥气体体积流量为11 L/min，干燥气体温度为250 ℃，毛细管电压为4000 V，雾化器压力为0.30 MPa，碎裂电压为365 V，质量扫描范围为/100～1500。

2.3.2 二级质谱条件 电喷雾离子源，正离子模式检测，干燥气体气温为325 ℃，干燥气体体积流量为6 L/min，雾化器压力0.30 MPa，鞘气气体温度400 ℃，鞘气气体体积流量为12 L/min，毛细管电压4000 V，Q-TOF碎裂电压365 V，质量扫描范围/50～2500。

2.4 全时段多波长指纹图谱融合方法

采用DAD二极管阵列检测器对QBT在200～400 nm对混合对照品进行扫描，选择能够满足所有活性成分的峰面积最大值，经过扫描得到波长确定为248、270、283、290、306 nm。根据文献采用全时段多波长融合技术[5]，分别从Agilent 1290色谱工作站中导出248、270、283、290、306 nm的dif格式数据文件，使用Matlab软件编程，对dif格式数据进行全时段多波长融合，得到同时反映5个波长信息的色谱图。

2.5 指纹图谱方法学考察

根据上述“2.2”项下方法对9个生产企业58批次QBT进行测定，并对其精密度、稳定性、重复性进行考察。以相对独立的12号峰（淫羊藿苷）作为参比峰，对其他峰的相对保留时间和相对峰面积进行计算。

2.5.1 精密度考察 取BQ-D样品按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，测定并记录色谱图，以12号峰为参照峰，该峰为所有样品共有且峰面积较大、分离较好，考察各主要色谱峰与参比峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，计算相应RSD值，各色谱峰的相对保留时间的RSD＜1.0%，相对峰面积的RSD＜3.0%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性考察 取BQ-D供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别在供试品溶液制备后的0、2、4、6、12、24 h重复进样6次，结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.03%～0.67%，相对峰面积的RSD在0.29%～3.33%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性考察 按“2.1.1”项下方法制备6份BQ-D供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.30%～2.30%，相对峰面积的RSD在0.30%～2.81%，说明方法重复性良好。

2.6 指纹图谱的建立及相似度的计算

将58批QBT样品按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按上述“2.2”项下色谱条件进行测定，结果16个峰为QBT的共有峰，且这些峰的峰面积总和占总峰面积的90%以上。对所得出的58批样品指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版”进行分析，9个生产企业样品的指纹图谱以BQ-D样品图谱作为相似度计算校正的参照谱，采用中位数法生成对照图谱（R），各厂家部分代表性批次样品的指纹图谱见图1，计算各厂家各批次与对照指纹图谱的相似度，结果见表2。

图1 58批次QBT UPLC指纹图谱

表2 各样品UPLC指纹图谱的相似度

2.7 QBT共有峰确认和归属

2.7.1 指纹图谱药材归属分析 根据QBT的生产工艺，将处方中的11味药材均经水煎，浓缩。再分别根据“2.1.3”项各药材对照品溶液制备方法制备，按“2.2”项下色谱条件测定。根据紫外光谱信息，对全方与药材指纹图谱中的相关峰进行归属，确认峰1、4～8归属枳壳药材，峰2、3、15、16归属虎杖药材，峰9～12、14归属淫羊藿药材，峰13归属黄芪药材（图2）。其余原料药材的色谱图在此检测条件下信息量较少，有待进一步研究。

2.7.2 对照品法指认各共有峰 取“2.1.2”混合对照品进样，按“2.2”项下色谱条件测定。结果见图2。通过与样品色谱图比较对照品的保留时间并扫描对比其紫外吸收光谱，从而初步猜测1号峰为辛弗林，2号峰为虎杖苷，3号峰为金丝桃苷，4号峰为新圣草苷，5号峰为柚皮苷，6号峰为橙皮苷，7号峰为新橙皮苷，8号峰枸橘苷，9号峰为朝藿定A，10号峰为朝藿定B，11号峰为朝藿定C，12号峰为淫羊藿苷，13号峰为芒柄花素，14号峰为宝藿苷I，15号峰为大黄素，16号峰为大黄素甲醚。

1-辛弗林 2-虎杖苷 3-金丝桃苷 4-新圣草苷 5-柚皮苷 6-橙皮苷 7-新橙皮苷 8-枸橘苷 9-朝藿定A 10-朝藿定B 11-朝藿定C 12-淫羊藿苷 13-芒柄花素 14-宝藿苷I 15-大黄素 16-大黄素甲醚

2.7.3 UPLC-Q-TOF-MS指认各色谱峰 为进一步阐明QBT指纹图谱表征的化学成分，采用UPLC-Q- TOF-MS技术对色谱峰进行确认。由于QBT的处方药味多，化学成分差别较大，故同时采用正、负离子模式进行扫描见图3，从图3中可以看出负离子流图离子峰较少，正离子流图都能涵盖，所以最终采用正离子模式。通过质谱中分子离子峰和碎片离子峰的信息，结合紫外吸收光谱特征，与相关文献报道以及对照品进行对照，鉴定了QBT指纹图谱中16个色谱峰，结果见表3。

图3 QBT样品的总离子流图

表3 QBT的UPLC-MS分析结果

2.8 样品数据聚类分析

将各生产企业QBT样品指纹图谱的16个共有峰相对于参照峰12号，采用SPSS 19.0软件对所有QBT样品进行系统聚类分析。采用组间连接法，利用平方Euclidean距离（squared Euclidean distance）为测度，计算不同样品间相似程度，结果见图4。

图4 QBT的聚类分析图

聚类分析将不同厂家的样品大致分为4类：一类包括生产企业为BQ、SL、SX、YST的样品，其相似度较高，一般大于0.8；二类包括生产企业WG、WH、CC、YH的样品，该类相似度相对较低在0.6～0.7；三类包括生产企业JEJ、CC的样品，该类样品相似度不高且较分散，质量差异性较大；四类包括生产企业有WH、WG、SL、BQ、SX的个别的样品，该类为个别生产企业相似度较低的分为这一组。WG、WH、CC的各批次样品较分散，表明这些企业的生产工艺不是十分稳定。同厂家的样品基本聚在同一类中，也有个别的生产企业分为几类，分类基本与不同的生产批号一致。聚类分析得到的样品之间的相关性，与相似度计算得到的样品之间的相关性，结果较一致。聚类分析更能直观地看出各生产企业之间的区别。

3 讨论

3.1 实验条件的选择

本实验比较了回流和超声2种提取方法；提取溶剂考察了50%乙醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇5种提取溶剂；溶剂用量考察了25、50 mL；以及超声时间15、30、45、60 min进行了考察，结果表明采用25 mL 50%甲醇超声处理45 min即可完全提取。分别考察了甲醇-水系统，乙腈-水系统，乙腈-0.1%甲酸水，乙腈-0.5%甲酸水4个溶液系统，最终选择乙腈-0.1%甲酸水系统。指纹图谱的检测波长选用248、270、283、290、306 nm 5个波长进行全时段融合。

3.2 相似度及聚类分析

对所测9个生产企业样品的UPLC指纹图谱进行比较，实验结果表明，指纹图谱相似度结果与聚类分析的结果基本一致。BQ、SL、SX、YST 4个生产企业样品相似度较高，质量一致性较好；WG、WH、CC 3个生产企业样品指纹图谱的相似度较分散，主要考虑与样品的生产工艺参数不稳定或原料药材的质量稳定性相关，导致生产批号较远的样品质量差异明显。而另有JEJ、YH生产企业样品指纹图谱的相似度低也有分散，与其他厂家的样品指纹图谱比较发现，其色谱图中来源于枳壳中的柚皮苷和新橙皮苷的含量较低。

3.3 化学成分指认分析

本实验采用UPLC-Q-TOF-MS技术对QBT进行定性的分析。通过对一级、二级质谱中分子离子峰和碎片离子峰的信息进行分析，结合紫外吸收光谱特征，并与相关文献报道[6-11]以及对照品进行对照，鉴定出了QBT指纹图谱中16个色谱峰。如总离子流色谱图中的6号峰橙皮苷（R＝19.039 min）和7号峰新橙皮苷（R＝21.182 min）在正离子模式下显示出相同的准分子离子峰/633.2 [M＋Na]+峰，二级质谱均产生/487.1离子，应该为黄酮类苷元[Y1＋Na]+碎片离子峰，/331.1离子，应该为[B2＋Na]+碎片离子峰，但是7号峰新橙皮苷还存在/179.1离子，应该为[A0＋H2＋H]+碎片离子峰，通过结合对照品对比以及查阅相关文献报道[9]，故确认6号峰为橙皮苷，7号峰为新橙皮苷。用类似方法其余14个色谱峰经UPLC-Q-TOF-MS分析均与对照品的质谱裂解规律一致，并且化学物质组主要包含4类有效组分，分别为①黄酮类化合物：1、4～14号峰依次为辛弗林、新圣草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、芒柄花素、宝藿苷；②二苯乙烯化合物：2号峰虎杖苷；③黄酮醇苷类：3号峰金丝桃苷；④蒽醌类化合物：15号峰大黄素和16号峰大黄素甲醚。QBT的有效成分以黄酮类化合物为主要成分。

综上所述，本实验以QBT为研究对象，首次建立其UPLC指纹图谱，指认了其中16个峰的化学成分，并确定了这16个化学成分的归属药材。将建立的指纹图谱应用于9个生产厂家58批次样品的质量评价，通过相似度计算，发现不同厂家QBT的质量差异较大，现行标准的质量控制内容难以保证临床疗效稳定，而UPLC指纹图谱[12-15]更全面表征不同厂家药品的质量信息，较常规检验和单个成分定量测定，更能全面反映该制剂质量的一致性和稳定性[16-18]，对QBT的质量比较与评价有更积极的意义，为保证临床用药的安全性、有效性和稳定性提供了方法和依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Fingerprint of Qianlie Longbitong Tablets from different manufacturers by UPLC-Q-TOF-MS

CUI Lu1, CHU Zheng1, KANG Ting-guo2, ZHAO Qing-chun1, KANG Ye1

1. General Hospital of Northern Theater Command, Shenyang 110032, China 2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China

To establish an UPLC fingerprint of Qianlielong Bitong Tablets (前列癃闭通片, QBT) for quality evaluation of 58 batches of QBT from nine different manufacturers, so as to support the foundation of quality control system of the tablets.The method was performed by UPLC with Eclipse Plus C18RRHD (50 mm × 2.1 mm, 1.8 µm) column; acetonitrile-0.1% formic acid aqueous as the mobile phase for gradient elution, with the all-time multi-wavelength fusion. The flow rate was 0.3 mL/min, column temperature was 30℃. The HPLC fingerprint was established and evaluated by the similarity evaluation system of QBT, the quality of 58 batches of samples was evaluated by cluster analysis. The chemical constituents of the main common peaks were identified in the fingerprint and attributed to raw materials.The UPLC fingerprint of QBT was developed firstly, the chemical constituents of 16 common peaks were identified, including synephrine (peak 1), polydatin (peak 2), hyperoside (peak 3), neoeriocitrin (peak 4), naringin (peak 5), hesperidin (peak 6), neohesperidin (peak 7), poncirin (peak 8), epimedin A (peak 9), epimedin B (peak 10), epimedin C (peak 11), icariin (peak 12), formononetin (peak 13), baohuoside (peak 14), emodin (peak 15), physcion (peak 16), and the 16 characteristic peaks were determined from four traditional Chinese medicines. The peaks 1, 4—8 were attributed to Zhiqiao (), the peaks 2, 3, 15, 16to Huzhang (et), the peaks 9—12, 14to Yinyanghuo (), the peak 13to Huangqi (). The analyzed samples were geographically classified into four classes with the similarities between 0.600—0.912.The fingerprint of QBT was developed, the method is simple and reliable. It provides reference for further evaluation and monitoring the quality of QBT.

UPLC-Q-TOF-MS; Qianlielong Bitong Tablets; quality evaluation; fingerprint; similarity; cluster analysis; all-time multi-wavelength fusion; synephrine; polydatin; hyperoside; neoeriocitrin; naringin; hesperidin; poncirin; epimedin; icariin; formononetin; baohuoside; emodin;;et;;

R286.02

A

0253 - 2670(2021)24- 7493 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.011

2021-06-28

崔 璐，女，硕士，主管中药师，研究方向中药鉴定与品质评价。E-mail: 1031706465@qq.com

康 烨，女，硕士，主管药师，研究方向临床药理。E-mail: liushixun0822@163.com

[责任编辑 郑礼胜]