大学生肠道阴沟肠杆菌与体质指数的相关性研究

罗春雨，李亚飞，刘 奇

（大理大学基础医学院，云南大理 671000）

肠道菌群与体脂沉积和肥胖的发生有着密切的联系〔1〕，肠道菌群影响着人体的营养吸收、免疫功能及代谢作用〔2-3〕。阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）属于肠杆菌科肠杆菌属，为革兰氏阴性粗短杆菌，是肠道正常菌种之一，也是重要的条件致病菌。赵立平等〔4〕在对肠道菌群的研究中发现，患者肥胖与肠道的阴沟肠杆菌有直接联系。伊红美蓝培养基可以初步分离革兰氏阴性肠道致病菌，在该选择培养基上，大肠埃希菌呈现紫黑色金属光泽菌落，产气肠杆菌呈棕色的大菌落，沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落，阴沟肠杆菌为粉色大菌落，因此使用该选择性培养基可对肠道杆菌作初步筛选。本研究采用Spearman 秩相关系数法，分析阴沟肠杆菌在肠杆菌科中的菌落数比例与在校学生体质指数（body mass index，BMI）的相关性，从而对阴沟肠杆菌与在校大学生肥胖的关系进行探究〔5〕，进一步为个体化的科学减肥方法提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 大理大学在校42 名健康大学生新鲜粪便0.5～3.0 g；阴沟肠杆菌标准菌株ATCC 700323，由大理大学病原生物学综合实验室提供，于－80 ℃冰箱保存。

1.1.2 试剂 伊红美蓝培养基、营养琼脂培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）；10×PCR Mix、100 bp DNA Marker（南京赛泓瑞生物科技有限公司）；Tris 饱和酚（宜兴市广汇助剂化工有限公司）；氯仿、异戊醇（上海迈瑞尔化学技术有限公司）；引物由苏州金智唯生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 形态学检测 将所得粪便标本分别进行涂片、革兰氏染色，显微镜下观察。

1.2.2 标本的稀释和培养 用无菌0.9%氯化钠溶液以10 倍稀释法稀释0.1 g 新鲜粪便。用无菌棉签将稀释后的标本均匀涂布于伊红美蓝培养基上，37 ℃培养24 h。确定最佳稀释梯度为10－3～10－4g/mL。再将该稀释浓度的粪便样品涂布于伊红美蓝培养基上，每份样品重复3 次，37 ℃培养24 h。记录疑似阴沟肠杆菌的粉色菌落数，并计算菌落的比例。

1.2.3 菌种PCR 鉴定 参考文献〔6-7〕，合成阴沟肠杆菌特异性引物，正向引物：5′-CATGACACCGGT GTTTCCCCAGT-3′；反向引物：5′-CGGTCGGTGAAG CCCAGAACCACTA-3′。选取疑似阴沟肠杆菌进行菌落PCR 鉴定，PCR 扩增反应的体积为20 μL。用2% 琼脂糖凝胶进行电泳分离，凝胶成像系统观察并拍照〔8〕。

1.2.4 数据统计与分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行统计分析，计数资料用（±s）表示。用Spearman秩相关进行结果的相关性分析，检验水准α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 粪便涂片革兰氏染色结果 将42 份粪便标本进行涂片染色，显微镜下观察。每份均按照革兰氏阳性（G+）杆菌、革兰氏阳性（G+）球菌、革兰氏阴性（G-）杆菌、革兰氏阴性（G-）球菌分类依次计数，并计算所占比例。4 种菌落所占的比例分别为：（30.0±11.7）% ，（20.0 ±13.3）% ，（32.3 ±15.1）% ，（17.6 ±8.7）%。涂片结果显示阴沟肠杆菌所属的G-杆菌比例最高。

2.2 阴沟肠杆菌培养结果 将粪便标本以10-3、10-4g/mL 两个稀释浓度均匀涂布在伊红美蓝培养基上，分类和计数全部菌落。统计粉色菌落的疑似阴沟肠杆菌菌落数及所占比例。结果显示，阴沟肠杆菌所占比例为（25.7±23.5）%。其中，男性（35.3±24.3）%，女性（16.1±18.7）%，男性阴沟肠杆菌比例大于女性（P=0.007）。

2.3 阴沟肠杆菌菌落PCR 鉴定结果 参考文献〔7〕，特异性引物扩增的385 bp 大小的特异性条带为阴沟肠杆菌部分基因序列。菌落PCR 鉴定结果中，1号和21 号泳道为阴沟肠杆菌的标准菌株，385 bp附近可见清晰条带。见图1。扩增序列中有13 份PCR 阳性的菌株在标准条带300～400 bp 之间，与标准菌株的条带位置一致。由此确证，伊红美蓝培养基中的粉红色菌落为阴沟肠杆菌。

图1 阴沟肠杆菌菌落PCR 鉴定结果图

2.4 大学生BMI 分布 目前国际上常用的衡量人体胖瘦程度的标准为BMI〔9〕。BMI＜18.5 kg/m2为体质量过低；18.5 kg/m2≤BMI＜24.0 kg/m2为体质量正常；24.0 kg/m2≤BMI＜28.0 kg/m2为体质量超重；BMI≥28.0 kg/m2为肥胖。统计42 名大学生的BMI，其平均值为（22.2±3.8）kg/m2，具体分布情况见表1。

表1 大学生BMI 分布表（n=42）

2.5 不同BMI 组的阴沟肠杆菌菌落比例比较 进一步统计分析不同BMI 组阴沟肠杆菌的菌落比例。见图2。其中，过低组阴沟肠杆菌菌落比例为（6.3±4.2）%，正常组为（20.9±18.3）%，超重组为（34.0±24.5）%，肥胖组为（64.0±32.2）%。由图2 可见，4 个组中BMI 值越高，阴沟肠杆菌菌落比例也越高。但经卡方检验Fisher′s 确切概率法得P=0.277＞0.05，即各组间阴沟肠杆菌菌落比例的差异无统计学意义，推测此结果与样本量偏低有关。

图2 不同BMI 组阴沟肠杆菌比例分布图

2.6 BMI 与阴沟肠杆菌菌落比例的相关性分析阴沟肠杆菌菌落比例与体质量之间呈正相关。见图3。将两者进行相关性分析，得到Spearman 秩相关系数rs= 0.529 ＞0.5（P＜0.001）。由结果可知BMI 与阴沟肠杆菌菌落比例之间呈正相关，且相关具有显著性，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图3 阴沟肠杆菌菌落比例与BMI 的相关性

3 讨论

肥胖是以脂肪代谢失衡为表现特征的一种营养性代谢紊乱疾病，已严重影响人类健康。肠道菌群可促进与脂肪合成相关的基因表达，并使肝脏脂肪细胞积累甘油三酯。此外，人体肠道内存在相对复杂的微生物群体，微生物群体不同，代谢效率也不同。不同的微生物组成会促进脂肪的能量储存，或阻碍脂肪的消耗，从而导致肥胖。肠道内复杂的微生物菌群与人体的机体环境，以及外界环境的相互作用，会影响机体的营养、免疫和代谢〔10〕。肠道内壁上的保护屏障可抑制致病病原菌的入侵以及生长，它是由肠道菌群附着形成的，从而发挥对机体的保护功能〔11〕。

进入21 世纪，随着我国经济的快速发展，全国大学生的肥胖问题，已成为影响中国大学生身心健康的最重要因素之一〔12〕。2013年，美国医学会就肥胖是一种疾病进行了正式的宣告〔13〕，世界卫生组织称，截至2016年，全球肥胖人口超过6.5 亿，预计到2030年全球肥胖患者将达到11.2 亿〔14〕，肥胖患者人数在中国也在不断增加。研究表明，肥胖对学生的血糖、心肺系统和心理健康有不同程度的影响，肥胖在未来的发展中会继续影响儿童的健康〔15〕。如何预防肥胖流行已成为21 世纪上半叶全球面临的最重大的公共卫生挑战。

近年来，对影响人类肥胖的大量研究表明，环境因素具有重要的作用，其中尤为重要的是人类肠道系统中的共生微生物〔16-17〕。刘洋〔18〕发现人体的肠道菌群与体脂沉积、肥胖的发生发展有密切关系；赵立平在临床研究中发现一位肥胖患者肠道阴沟肠杆菌过度增长，而在该患者体质量恢复正常后，阴沟肠杆菌数量降至检测不到的水平〔4〕。这是首个关于肠道细菌引起肥胖症的最直接的证据。

本研究发现，体质量过低组、正常组、过高组和肥胖组的粪便标本中，阴沟肠杆菌的菌落比例依次增加。此外，相关性分析发现，大学生阴沟肠杆菌菌落比例与其BMI 呈现显著正相关。这在另一个侧面，佐证了阴沟肠杆菌可能是影响肥胖的重要因素之一。然而，肠道阴沟肠杆菌如何影响BMI 等一系列问题，还需要进一步的研究。