VEGF-C、CCL21及Bmi-1蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义

惠志龙 张利萍 王龙影 王慧

作者单位：1.河北北方学院附属第一医院妇科，河北，张家口075000

2.河北北方学院附属第一医院妇产科，河北，张家口075000

卵巢癌是威胁女性健康的一种恶性肿瘤，约占女性恶性肿瘤的3%～4%，其病死率位居妇科恶性肿瘤首位［1］。肿瘤侵袭性生长与转移是导致患者预后不良的关键，而淋巴管的生成及淋巴结转移在其中扮演重要角色。血管内皮细胞生长因子C（Vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）是一种重要的淋巴管生成因子，在促进新生淋巴管内皮细胞的增殖和迁移方面具有重要作用［2］。B 细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1（B-cell-specific Moloney leukemia virus insertion site-1，Bmi-1）是一种广泛表达的核蛋白，参与细胞增殖的调控［3］。趋化因子与肿瘤器官特异性转移有关，相关研究显示，肺癌、乳腺癌及卵巢癌中均有趋化因子及其受体的表达增高，其中趋化因子21 主要由淋巴管内皮细胞分泌，在卵巢癌淋巴转移中具有重要作用［4］。基于此，本研究通过检测VEGF-C、C-C 趋化因子配体（C-C chemokine ligand，CCL21）及Bmi-1 在上皮性卵巢癌组织中的表达情况，探讨其表达及与微淋巴管生成、患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取河北北方学院附属第一医院2017年1月至2020年1月收治的82 例上皮性卵巢癌患者术中所取癌组织纳入研究组，平均年龄为（47.56±9.36）岁；临床分期：Ⅰ期16 例，Ⅱ期12 例，Ⅲ期30例，Ⅳ期24 例；病理类型：浆液性癌43 例，黏液性癌39 例；淋巴结转56 例；病理分级G116 例，G231 例，G335 例。纳入标准：①均符合上皮性卵巢癌的诊断标准［5］；②初次手术者；③临床资料无缺失或丢失；④未进行化疗、放疗等治疗者。排除标准：①心脏、肝肾功能不全；②合并免疫功能、血液功能障碍者；③合并其他恶性疾病；④中途退出者。并选取距癌组织3 cm 处的癌旁组织作为对照组。本研究经院医学伦理委员会批准通过，受试者或其家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂

鼠抗人VEGF-C 单克隆抗体，购自美国Neomarkers 公司；兔抗人CCL21 多克隆抗体，购自武汉博士德生物技术有限公司；兔抗人Bmi-1 单克隆抗体，购自上海生物技术有限公司。链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）免疫组化超敏试剂盒、胰蛋白酶及二氨基联苯氨酶底物显色试剂盒均购自福州迈新公司。

1.2.2 检测方法

标本均在手术后立即采集，用10%甲醛溶液固定后，常规脱水石蜡包埋。根据S-P 免疫组化染色法对VEGF-C、CCL21及Bmi-1蛋白进行检测，检测过程严格按照说明书进行。一抗阴性对照使用PBS（磷酸盐缓冲液）进行代替。

1.2.3 结果判断［6］

根据阳性细胞百分比、染色强度判定。①阳性标准为在细胞核或细胞浆内出血棕黄色或褐色颗粒。0 分为无色，1 分淡黄色，棕黄色2 分，棕褐色3 分。②阳性细胞率计算：从每张切片中随机选取5 个高倍视野并计算阳性细胞数，阳性细胞率=阳性细胞数/观察细胞数×100%。0 分：无阳性细胞，1 分：阳性细胞＜10%，2 分：10%～50%，3 分：50%～75%，4 分：＞75%。总积分：上述2 项评分的乘积。阳性：总积分＞4 分。

1.2.4 微淋巴管密度（Microlymphatic vessel densit，LVD）计数

采用低倍显微镜（×100）观察经SP 染色后切片，寻找LVD 相对最高处，即热点位置，随后在高倍显微镜（×400）下计数，D2-40定位于淋巴管内皮细胞胞浆或胞膜，呈棕色，对于着色内皮细胞或淋巴管内皮簇，只要它们和邻近的染色的淋巴管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，即可作为一个淋巴管计数，记录5个视野内的微淋巴管数，取其最高数作为LVD值［7］。

1.3 随访

以病例查询、电话或门诊复查的方式对患者进行1年随访（截止时间2021年1月），分析影响其56预后生存的危险因素。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计量资料采用（）表示，采用t检验；计数资料采用n（%）表示，采用χ2检验；采用Pearson 法对各参数进行相关性分析；采用多元Logistic 回归分析影响上皮性卵巢癌患者1年预后生存的相关危险因素，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF-C、CCL21及Bmi-1 在各组的表达情况

研究组VEGF-C、CCL21及Bmi-1 阳性表达率均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 VEGF-C、CCL21及Bmi-1 在各组的表达情况［n（%）］Table 1 expression of VEGF-C，CCL21 and Bmi-1 in each group［n（%）］

图1 免疫组化图（SP，×400）Figure 1 Immunohistochemistry map（SP，×400）

2.2 上皮性卵巢癌病理特征与VEGF-C、CCL21、Bmi-1及LVD 的关系

上皮性卵巢癌临床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移及病理分级G3级者VEGF-C、CCL21 阳性表达率显著高于上皮性卵巢癌临床分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移及病理分级G1～G2级者，差异有统计学意义（P＜0.05）。上皮性浆液性卵巢癌、临床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移者Bmi-1 阳性表达率更高（P＜0.05）；且上皮性浆液性卵巢癌、临床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、病理分级G3级者LVD 值更高（P＜0.05）。见表2。

表2 上皮性卵巢癌病理特征与VEGF-C、CCL21、Bmi-1及LVD 的关系［n（%），（±s）］Table 2 Relationship between pathological features of epithelial ovarian cancer and VEGF-C，CCL21，Bmi-1 and LVD［n（%），（±s）］

表2 上皮性卵巢癌病理特征与VEGF-C、CCL21、Bmi-1及LVD 的关系［n（%），（±s）］Table 2 Relationship between pathological features of epithelial ovarian cancer and VEGF-C，CCL21，Bmi-1 and LVD［n（%），（±s）］

病理特征年龄肿瘤直径组织学类型临床分期淋巴结转移病理分级＜45 岁≥45 岁＜10 cm≥10 cm浆液性黏液性Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ有无G1-G2 G3 n 38 44 32 50 43 39 28 54 56 22 47 35 VEGF-C 阳性22（44.00）28（56.00）19（38.00）31（62.00）29（58.00）21（42.00）12（24.00）38（76.00）41（82.00）9（18.00）21（42.00）29（58.00）χ2值0.328 0.057 1.589 5.866 7.163 12.287 P 值0.567 0.812 0.208 0.015 0.007＜0.001 CCL21 阳性26（44.83）32（55.17）22（37.93）36（62.07）33（56.90）25（43.10）13（22.41）45（77.59）46（79.3）12（20.69）25（43.10）33（56.90）χ2值0.183 0.100 1.579 12.131 6.309 16.365 P 值0.669 0.752 0.209＜0.001 0.012＜0.001 Bmi-1 阳性26（46.43）30（53.57）25（44.64）31（55.36）35（62.50）21（37.50）13（23.21）43（76.79）44（78.57）12（21.43）36（64.29）20（35.71）χ2值0.001 2.3430.126 7.1680.007 9.3870.002 4.5030.034 0.5390.463 P 值0.981 LVD 值12.07±3.02 11.59±2.98 12.15±3.34 11.06±2.38 12.78±3.69 10.89±1.32 9.29±1.88 15.45±3.47 15.72±4.89 8.88±2.94 10.11±3.45 16.21±4.77 χ2值0.723 1.7250.088 3.0170.003 8.735 6.126 6.723 P 值0.472＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 VEGF-C、CCL21、Bmi-1 与LVD 的相关性

相关性分析结果显示，VEGF-C（r=0.647）、CCL21（r=0.584）及Bmi-1（r=0.576）与LVD 均呈正相关关系（P＜0.05）。

2.4 影响上皮性卵巢癌患者预后的单多因素分析

临床分期（Ⅲ～Ⅳ期）、淋巴结转移（有）、病理分级（G3）、VEGF-C（阳性）、CCL21（阳性）及Bmi-1（阳性）为影响上皮性卵巢癌患者预后生存的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响上皮性卵巢癌患者预后的单多因素分析Table 3 univariate and multivariate analysis of prognosis in patients with epithelial ovarian cance

3 讨论

上皮性卵巢癌是临床常见恶性疾病，早期无特异性症状，大部分患者就诊已是晚期，预后不佳［8］。目前淋巴管形成已成为国内外研究热点，已有临床研究证实，淋巴管形成是卵巢癌恶性进展的关键步骤［9］。因此需对上皮性卵巢癌发病、发展机制进行研究，并寻找、开发新治疗靶点以改善上皮性卵巢癌患者预后。

VEGF-C 是近年来发现的介导肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移的重要因子，其可通过调节原有淋巴管内皮细胞间的细胞分泌方式，促进原有淋巴管增生，并与新生淋巴管相互吻合，形成淋巴管网，使得肿瘤细胞通过淋巴管间的吻合进入淋巴管，并发生转移，影响患者预后［10-11］。已有多项研究表明，VEGF-C 与卵巢癌、胰腺癌及乳腺癌等多种恶性疾病的淋巴结转移、预后有着密切的相关性［12］。CCL21 是一种主要表达于外周免疫器官或组织的趋化因子，通过作用于趋化因子受体7，介导淋巴细胞与经抗原分化的树突状细胞进入淋巴管。Cunnea 等［13］报道发现，在肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中CCL21 呈高表达，并促进了肿瘤细胞增值、分化，CCL21 参与了癌细胞侵袭、转移过程。Bmi-1是多梳基因家族成员之一，在白血病、淋巴瘤的发生、发展中具有重要作用。国外有研究发现，Bmi-1在多数人体正常组织中无表达或呈低表达，在多种肿瘤组织或细胞中表达明显上调，且与患者预后不良有关，被认为是一种潜在的癌基因［14］。

本研究发现，VEGF-C、CCL21及Bmi-1 在正常组织中的阳性表达率均显著低于上皮性卵巢癌组织。进一步分析发现，多数的临床晚期（Ⅲ～Ⅳ期）Bmi-1 呈过度表达，仅少数临床早期（Ⅰ～Ⅱ期）者VEGF-C、CCL21及Bmi-1 呈过度表达。国外报道显示，VEGF-C、CCL21及Bmi-1 高表达与患者淋巴结转移、病理类型、病理分级有关［15］。但本研究上述因子中仅Bmi-1 高表达与患者病理类型有关，VEGF-C、CCL21 表达与患者病理类型无显著相关性，分析其原因可能与样本量纳入偏少、患者自身因素等有关。此外本研究通过分析VEGF-C、CCL21及Bmi-1 与LVD 相关性发现，VEGF-C、CCL21及Bmi-1 均与LVD 呈显著正相关。上述结论均提示，VEGF-C、CCL21及Bmi-1蛋白过度表白可能在上皮性卵巢癌发生、发展中担当重要作用，参与了部分肿瘤浸润、淋巴结转移等恶性进程。本研究还发现，VEGF-C、CCL21及Bmi-1 阳性表达均是影响上皮性卵巢癌患者预后生存的危险因素。推测可能是由于VEGF-C、CCL21及Bmi-1 过度表达可刺激微淋巴管生成，癌细胞通过脉管间隙侵入脉管系统而导致淋巴结转移，影响患者预后。

综上所述，上皮性卵巢癌VEGF-C、CCL21及Bmi-1 过度表达可能促进微淋巴管生成，是影响患者预后不良的危险因素。