流感嗜血杆菌核酸检测试剂盒国家参考品的建立

黄洋 李康 徐潇 李江姣 王春娥 梁丽 陈驰 刘茹凤 叶强

作者单位：中国食品药品检定研究院中国医学细菌保藏管理中心，北京102629

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza，HI）是一种短小的革兰阴性杆菌，根据荚膜多糖抗原的不同，可分为6 个血清型（a～f 型）［1］。HI 主要分布在咽部、鼻部及鼻咽部，是条件致病菌，也是社区性肺炎的主要致病菌［2］，临床上主要引起非侵袭性疾病如肺炎、急性中耳炎、急性鼻窦炎、中耳炎及侵袭性疾病，如菌血症、中枢神经系统感染等［3-4］。尽管在接种HIb 疫苗后，侵入性HI 疾病的发病率已显著下降，但接种疫苗后，HI 血清型转换，导致HI 仍是某些疾病发病率、病死率高的原因［5-6］。近年来不少研究显示HI 在免疫缺陷人群中的感染率不断地上升［3］。因此，研究一种快速经济的检测方法对于HI 的早期诊断具有重要的研究意义。目前，流感嗜血杆菌的实验室诊断方法有细菌的培养和生化鉴定等传统方法，然而传统的方法存在一定的局限，如时间长、通量低、干扰因素多，无法满足临床大量样本的诊断需求。近年来实时荧光PCR（real-time fluorescent PCR，Rt-PCR）由于其快速、易操作、高通量和高灵敏度等优势，以此为基础研发的试剂盒成为各个企业研发的主流产品。但是，尚无相关的国家参考品供企业对其研发的试剂盒进行质量控制和评价。为解决这一问题，本研究选择了10 株不同血清型流感嗜血杆菌和10 株与流感嗜血杆菌感染部位相同或感染症状相似且常见的非流感嗜血杆菌制备成一套流感嗜血杆菌核酸检测试剂盒用国家参考品，通过对参考品开展确证、分装均匀性、稳定性评估、协作标定，旨在研制适用于荧光定量PCR 方法的流感嗜血杆菌核酸检测试剂盒国家参考品，用于该类试剂盒质量的评价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 参考品原料

流感嗜血杆菌CMCC（B）58533、58552、58558、58561、58573、58566、58567、58568、58574、58525 和非流感嗜血杆菌［脑膜炎奈瑟菌CMCC（B）29052，肺炎克雷伯CMCC（B）46117，铜绿假单胞菌CMCC（B）10104，金黄色葡萄球菌CMCC（B）26001，肺炎链球菌CMCC（B）31001，A 族链球菌CMCC（B）32067，白喉棒杆菌CMCC（B）38102，卡他布朗汉姆氏菌CMCC（B）29118，百日咳博德特菌CMCC（B）58039，嗜肺军团菌CMCC（B）60001］均来源于中国医学细菌保藏管理中心。

1.1.2 试剂及主要仪器

GC 基础培养基（批号：7297698，500 g/瓶）、血红蛋白粉（批号：7325834，500 g/瓶）和脑心浸液（批号：5139642，500g/瓶）均购自美国BD 公司；0.9%氯化钠注射液（批号：1912293102，100 mL/瓶）购自石家庄四药有限公司；NU-5810E 型二氧化碳培养箱购自美国NUAIRE 公司；7500 型荧光定量PCR 分析系统购自ABI 公司；国家细菌浊度标准（国家药品标准物质中心）由中国食品药品检定研究院提供。

1.1.3 检测试剂

确证试剂盒来自上海之江生物科技股份有限公司和中山大学达安基因股份有限公司；协作标定试剂盒分别来自北京卓诚惠生生物科技股份有限公司、广东和信健康科技有限公司、苏州天隆生物科技有限公司、上海之江生物科技股份有限公司、重庆中元汇吉生物技术有限公司、上海捷诺生物科技有限公司和中山大学达安基因股份有限公司（分别编号为A-G）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的培养及参考品原菌液的定值

10 株HI 菌株和10 株非HI 菌株分别选择合适的培养基和培养条件进行复苏、传代培养。刮取第2 代培养物溶于一定体积的注射用生理盐水中，制备成菌悬液，除卡他布朗汉姆氏菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、白喉棒状杆菌、肺炎克雷伯菌采用活菌计数法外，其余参考品的定值采用比浊法。计数后的菌悬液置于60℃水浴中，灭活30～45 min，计数前后的菌悬液分别接种于各自合适的培养基和培养条件中检测灭活效果，同时将灭活前的培养物进行形态学、生理生化特性分析，并提取基因组进行分子生物学特征分析，确保所选菌株的无污染，于-20℃以下保存。

1.2.2 参考品的制备

使用注射用生理盐水将10 株上述HI 菌悬液稀释至106/mL 并分装成0.5 mL/管，即阳性参考品（P1～P10）。脑膜炎奈瑟氏菌的菌悬液稀释至106/mL，其余9 株非HI 菌株的菌悬液稀释至107/mL，均分装成0.5 mL/管，即阴性参考品（N1～N10）。CMCC（B）58561 的菌悬液稀释至106/mL，定量分装，0.8 mL/管，于-20℃以下保存，即重复性参考品（3 管/套）和最低检出限参考品（1 管/套）。

1.2.3 参考品的确证

按照两种试剂盒的各自说明书方法检测参考品，对其进行确证，以下各试验中每份样本平行检测2 次，每个试剂盒进行2 次独立实验。

1.2.3.1 准确性 对阳性参考品（P1～P10）的10 倍稀释液进行检测，要求均为阳性。

1.2.3.2 特异性 对阴性参考品（N1～N10）的10倍稀释液进行检测，要求均为阴性。

1.2.3.3 重复性 对重复性参考品的10 倍稀释液进行检测，重复检测10 次，批内变异系数（CV）应≤5.0%。

1.2.3.4 最低检出限验证 将最低检出限参考品进行10 倍系列，稀释成104、103、102、10 个/mL，分别检测每个试剂盒的最低检出限。

1.2.4 分装均匀性验证

随机抽取阳性参考品、最低检出限参考品各10 支，重复性参考品15 支，使用上海之江生物科技股份有限公司生产的流感嗜血杆菌核酸测定试剂盒（荧光PCR 法）进行检测，要求均为阳性结果，且每个参考品均匀性的变异系数（CV）应≤5.0%。

1.2.5 参考品的稳定性验证

将阳性参考品、最低检出限参考品分别于2～8℃、25℃、37℃放置3 天、7 天、14 天，反复冻融3 次和5 次，以-20℃中保存的参考品作为对照，使用中山大学达安基因股份有限公司生产的流感嗜血杆菌核酸测定试剂盒（PCR-荧光探针法），考察放置于不同温度放置不同时间及反复冻的融参考品的稳定性。

1.2.6 参考品的协作标定

参照1.2.3 项，7 家参加协作标定的企业使用各自研发的诊断试剂对参考品进行验证，并对数据进行汇总分析。

1.3 统计学分析

使用SPSS 18.0 软件对稳定性数据进行定量资料的非参数检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参考品的确证

2.1.1 准确性

结果显示两家试剂盒对阳性参考品（P1～P10）均为阳性。

2.1.2 特异性

结果显示两家试剂盒对阴性参考品（N1～N10）均为阴性。

2.1.3 重复性

结果显示两家试剂盒批内变异系数（CV）分别为1.71%和1.37%、1.62%和1.47%，均小于5.0%。

2.1.4 最低检出限

两家试剂盒的最低检出限均为1.0×103个菌/mL。

2.2 参考品分装均匀性验证

抽取的10 份阳性参考品、最低检出限参考品以及15 份重复性参考品Ct 值的CV 均在5.0%以内，说明参考品的分装均匀度良好。见表1。

表1 参考品的分装均匀性结果Table 1 Detective result for packing uniformity references

2.3 参考品的稳定性验证

2.3.1 冻融稳定性评估

分别经反复冻融3、5 次处理后参考品的Ct值，与-20℃保存的参考品的Ct 值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 参考品冻融的稳定性分析Figure 1 The stability analysis of the references after repeated freezing-thowing

2.3.2 加速稳定性评估

分别于2～8℃、室温、37℃放置3、7、14 天后的参考品的Ct 值，与-20℃保存的参考品的Ct 值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 参考品加速稳定性分析Figure 2 The stability analysis of the references kept in different temperatures

2.4 参考品的协作标定

7 家企业的试剂盒检测的准确性、特异性和重复性结果均符合要求；最低检出限结果显示2 家为102个/mL、3 家为103个/mL、2 家在104个/mL 仍未检出。见表2。

表2 参考品的验证结果Table 2 erification results of references by using HI detection kits

3 讨论

流感嗜血杆菌能引发扁桃体炎、支气管炎、肺炎等呼吸道感染疾病，是儿童下呼吸道感染最常见的细菌［7］。目前临床上针对HI 的检测方法较多，但由于核酸的检测具有快速、简便等优势，受到越来越多的关注［8］。体外诊断试剂标准物质是实现临床检验标准化的主要工具，同时，国家参考品的制备和评价对于诊断试剂的质量控制至关重要［9］。核酸检测试剂国家参考品对于相关试剂盒的质量控制和评价至关重要，是相关产品注册检验、上市审批的重要物质基础［10］。本研究通过精心选择菌株研制出一套流感嗜血杆菌核酸检测试剂盒国家参考品，所选用的菌株均来自中国医学细菌保藏管理中心，阳性菌株的选择充分考虑了不同的血清型/群，以及感染的不同部位，阴性菌株的选择则兼顾了感染症状相似且常见的其他病原体。对建立的参考品进行了分装均匀度、冻融稳定性和加速稳定性评估，并开展了质量评价的研究。

本研究首先对分装后的参考品进行了确证，结果显示本参考品具有较好的准确性、特异性和重复性，最低检出限能达到为1×103个菌/mL。根据标准物质的研制要求［11-12］，对参考品的均匀性和稳定性进行了验证，均匀性检验中，随机抽取10 份阳性参考品和最低检出限参考品及15 份重复性参考品进行检测，结果显示抽取参考品Ct 值的CV 均在5.0%以内，说明参考品的分装均匀性满足要求；稳定性结果表明在冻融3 次、5 次以及2～8℃、室温、37℃放置3、7、14 天后，均具有较好的稳定性，能够满足不同条件下的运输及正常的使用。同时开展了试剂盒的协作标定，结果显示7 家企业的试剂盒准确性、特异性和重复性的检测结果均符合规定，最低检出限结果的差异可能与不同企业的试剂盒基因组提取效率和本身的灵敏度有关。

综上所述，本研究成功研制了流感嗜血杆菌核酸检测试剂盒国家参考品，研制的参考品经均匀性、稳定性考察和验证后，显示其可用于不同企业相关试剂盒的质量评价，为此类产品的评价提供了统一的标尺。但是研究仍缺少参考品长期稳定性数据，为此需在后续研究中应补充完整并持续监测。