粮食中黄曲霉毒素检测方法和俄罗斯进境粮食毒素防控措施的研究

刘振伟，张美燕

1.满洲里海关技术中心 (满洲里 021400)2.满洲里市疾病预防控制中心 (满洲里 021400)

粮食安全，是国家安全的同等大事。俄罗斯幅员辽阔，拥有丰富的农业资源，其土地肥沃丰产，农业条件优良，粮食品质较高。满洲里被国家批准为全国首批陆运指定粮食进口口岸，先后有俄罗斯油菜籽、亚麻籽、大麦、小麦等大宗粮食商品进入国内。针对这一工作，口岸检验检疫部门开展了粮食中黄曲霉毒素的检验检疫工作，为实现俄罗斯大宗粮食作物的顺利进境提供了技术保障。

黄曲霉毒素(Aflatoxin)主要由黄曲霉和寄生曲霉等真菌在代谢过程中产生，是一类结构相似的化合物。黄曲霉毒素目前已分离出 12 种，其中黄曲霉毒素B1被国际肿瘤研究机构(IARC)列为 I类致癌物质，是迄今为止人类所知的毒性和致癌性最强的物质之一，其急性毒性约为三氧化二砷的68倍、氰化钾的10倍，食用后会对其肝脏产生伤害，容易引发肝炎、肝硬化、肝坏死等病症[1]。黄曲霉毒素的发生受外界环境因素的作用，污染程度主要受农业生产、储藏与加工过程等环节影响。粮食在运输、贮藏过程中若管理不当，如受淋、受潮、通气不良、堆压时间过长容易产生黄曲霉毒素。因此，世界各国对粮食中黄曲霉毒素的含量做出了严格的规定。

1 限量要求

日本进口食品中黄曲霉毒素B1的限量标准要求最为严格，而欧盟标准不仅严格而且细致，可操作性较强。我国对粮食中黄曲霉毒素B1的限量标准规定为黄曲霉毒素B1≤5 μg/kg[2]。各国对黄曲霉毒素的限量要求见表1。

表1 黄曲霉毒素限量要求

3 检测方法研究进展

当前常用的黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、免疫分析法、液相色谱法、液质联用法、电子鼻法等[3]。

3.1 薄层色谱法(TLC)

黄曲霉毒素在波长365 nm的紫外光照射下发出蓝绿或蓝紫色荧光，通过颜色特征和规律可以检测出样品中黄曲霉毒素的含量和浓度[4]。薄层色谱法所用设备简单、费用低、易于掌握，适合大批量样品的筛选，一般实验室均可开展。由于该方法的特异性不强，样品中如果存在其他荧光物质，则会对结果产生干扰，大大降低检测结果的准确性。另外该方法样品前处理繁琐，操作步骤多并且提取和净化效果不够理想，因此该方法已经越来越不适应现代分析的要求，通常只作为化学分析法的一般佐证法。

3.2 免疫分析法

3.2.1酶联免疫吸附测定法(ELISA)

该方法具有特异性强、干扰小、灵敏度高、提取方法简单、分析时间短、检测成本低、操作安全无污染等特点，可以进行定性和定量测定，大大节约了测试成本，因而能广泛用于粮油中黄曲霉毒素的测定。但因酶促显色反应中酶的活性易受基质组成和操作条件影响，导致该方法准确度不高，可能出现重复性差、假阳性高等情况，还需要对盐和脂肪含量高的样品进行额外处理。张宁等[5]运用酶联免疫吸附技术结合间接竞争反应机制,开展黄曲霉毒素快速检测方法改进的研究，通过对饲料等11种样本的检测，得出添加回收率在67%～116%，灵敏度达到0.03 μg/L，线性系数>0.99，板内变异系数小于5%。

3.2.2胶体金免疫层析法(GICT)

该方法是一种将胶体金免疫技术与色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析方法，具有简便快速、灵敏度高、重现性好等特点，不需要任何仪器设备，可用于现场快速检测和初筛。缺点是灵敏度低，通常用来做定性检测[6]。王督等[7]研制出一种黄曲霉毒素B1胶体金免疫定量检测卡，用于大米、小麦等粮油产品中黄曲霉毒素B1的定量分析，方法的定量限为1.0 μg/kg，线性范围为1.0～20.0 μg/kg，该检测卡适用于稻谷及其制品中黄曲霉毒素B1筛查，样品检测时间只需15 min，具有简便、快速、灵敏度高、重现性好、检测成本低等特点。

3.2.3免疫生物传感器法(Mmune-Biosensor)

免疫生物传感器是由一种抗体和一种转导元件组成的一种分析装置，其中光、电、热等信号的变化是检测的重要指标，该方法不仅检测速度快，且成本低、灵敏度高、便携性高，使得生物传感器得到广泛应用[8]。欧阳秀酝等[9]构建了一种基于荧光共振能量转移的免疫传感器用于花生油样品中黄曲霉毒素B1检测，检测限为0.02 ng/mL，回收率为106%～112%，相对标准偏差低于4.7%，该方法具有高特异性和高灵敏度的特点，可用于食品中黄曲霉毒素B1的快速定量检测。

3.3 高效液相色谱法(HPLC)

该方法检出限低、准确性好、灵敏度高，是目前国际上普遍采用的定量筛选和确认的分析方法[10]。随着技术发展，对其进行了许多优化改进，改进主要集中在两个方面：一是着眼于前期黄曲霉毒素的分离净化，比如将免疫亲和柱与高效液相色谱联用，要比单一的高效液相色谱法更为安全、灵敏；另一方面采用液相色谱结合柱前或柱后衍生，荧光检测器检测，提高了灵敏度。GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中第二法和第三法高效液相色谱柱前/柱后衍生法适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定，柱前衍生法黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检出限均为0.03 μg/kg，柱后衍生法黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检出限分别为0.03 μg/kg、0.01 μg/kg、0.03 μg/kg、0.01 μg/kg[11]。

3.4 液相色谱质谱联用技术(LC-MS/MS)

质谱是目前粮食制品中真菌毒素痕量分析检测中使用最广泛且最高效的检测器，将液相与质谱联用，黄曲霉毒素的分析检测灵敏度和可靠性大幅提高。缺点是设备成本高，仪器操作复杂，过程较为繁琐、复杂，因此仍有较大提升空间。刘笑笑[12]等建立了一种同步检测粮食中 15 种真菌毒素的杂质吸附固相萃取-超高效液相色谱串联质谱方法，检出限0.2～15 μg/kg，平均回收率76.9%～116.1%，该方法在多毒素同时检测方面显示出广阔的应用前景。GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中第一法同位素稀释液相色谱串联质谱法测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检出限均为0.03 μg/kg，定量限均为0.1 μg/kg。

3.5 电子鼻法

电子鼻是一种电子感官仪，是近年来新兴的一种检测技术，由两大系统组成，传感系统和自动化识别系统[13]。能够快速的识别复杂气味和气体，建立气味的数学模型，通过模型可以迅速检测出霉变食物的特殊气味。该方法不直接检测黄曲霉毒素而是检测受黄曲霉毒素污染后一些挥发性物质的改变，是一种间接检测黄曲霉毒素的方法。沈飞等[14]利用此法检测糙米中黄曲霉毒素的污染，结果显示电子鼻信号与黄曲霉毒素有紧密相关性，并且对黄曲霉毒素B1的检测准确度最高，为粮食真菌毒素的早期预警提供了一种新思路和新方法。

4 防控措施

近年来，满洲里口岸进境俄罗斯粮食的品类和数量逐年增加，以加工贸易居主导地位，主要通过铁路运输运抵满洲里口岸进行加工。对进境俄罗斯粮食中黄曲霉毒素采用免疫亲和柱净化-液相色谱柱后衍生方法进行实验室检测，效果良好，保障了进境粮食安全。黄曲霉毒素的发生受外界环境因素的作用，污染程度主要受地理环境、农业生产栽培及收获后储藏、运输与加工过程等环节影响。为确保进境粮食不受黄曲霉毒素的污染，应从企业注册登记到贮藏、运输实施全链条监管并辅以实验室检测手段。

4.1 注册登记

对进境粮食境外生产、加工、存放企业实施注册登记制度。境外生产加工企业应当符合输出国家或者地区法律法规和标准的相关要求，并达到中国有关法律法规和强制性标准的要求。必要时可以派专家赴境外开展实地考察、生产加工存放企业检查、预检、监装等工作。有条件的进口俄罗斯粮食，按照WTO的规则，将俄罗斯输华粮食国际贸易的检疫风险影响降低到最低水平。进境粮食应纳入审批范围，控制进口数量，指定进口口岸，定点加工。

4.2 加强田间管理

粮食作物的抗霉能力与遗传因素有关，通过人工手段培育和选用抗侵染或抗产毒的品种，可以利用其自身的抗性来控制和提高抗黄曲霉侵染能力。实行轮作制度，科学栽培，合理施肥，做好病虫害防治工作。做好调查监测记录及农业化学品使用记录。合理排灌，确保生长期间对水分的需求，避免生长期间干旱。要准确把握种子的成熟度，一般成熟期前后一周内收获最佳，不要时间过长。

4.3 收获仓储运输过程控制

粮食收获储运过程中，相关企业应采取适当的过筛等清杂措施，以最大程度地去除土壤、杂草种子和植物秸秆、豆荚等残体，降低有害生物传带的可能性。收获后要及时在阳光下晒晾风干或烘干，使粮食含水量减至13%以下。仓储过程应采取防疫、防鼠等措施，并与其他粮食分开存储。理想的贮存条件是将粮食贮存于干燥低温状态，粮库要保持通风，相对湿度不超过70%，储存温度降至10 ℃以下[15]。采取袋装方式或专用运粮车运输，并采取必要措施防止雨水渗漏和撒漏。运输工具应符合安全卫生要求，防止有害生物随运输工具传播。

4.4 检验检疫监管

海关部门对进境粮食接卸、运输、仓储、加工等过程实施监督管理。应当对进境粮食实施现场检验检疫及实验室检测鉴定。经检验检疫合格的进境粮食，应在经所在地主管海关考核合格的加工企业监管加工使用，不得直接进入流通市场，严禁用作种用。从事进境粮食储运、加工的企业，应当具备有效的质量安全及溯源管理体系，应制定安全质量控制及防疫管理制度，包括防疫制度、疫情监测、应急处置等，对接卸、运输、存放、加工等全过程实施防疫安全控制措施，防止粮食撒漏，防止疫情扩散进入农业生产生态系统。粮食加工工艺须能有效杀灭杂草、病原菌等有害生物，加工过程产生的下脚料须集中焚烧处理。进境粮食装卸、储存、加工涉及不同海关的，各相关海关应当加强沟通协作，建立相应工作机制，及时互相通报检验检疫情况及监管信息。